miR-130b在人視網膜母細胞瘤中的表達及促癌機制研究

楊 夏，吳 濤

0引言

視網膜母細胞瘤(retinoblastoma，RB)是一種起源于視網膜胚胎性核層細胞的惡性腫瘤，其患病群體主要為5歲以下的嬰幼兒。相關流行病學研究顯示，RB在5歲以下兒童中的發病率為11.8/100萬，占同齡兒童惡性腫瘤的6.1%[1]。RB的死亡率在歐美發達國家為3%～5%，而在亞洲與非洲則高達40%～70%[2]。RB嚴重危害患兒的視力、生活質量乃至生命。近年來，隨著腫瘤綜合治療相關技術的革新與進步，趨于更微觀層次的分子靶向治療顯示出了愈發理想的治療前景，其中小分子核糖核酸(microRNA，miRNA)對其靶基因表達的調控對腫瘤發生及病情進展的影響逐漸成為該領域的研究熱點之一。新近研究表明，miR-130b在不同腫瘤組織中均存在表達異常的情況，且與腫瘤細胞增殖、浸潤、轉移、化療抵抗以及多項不良預后具有密切關聯[3-6]。但miR-130b是否對RB也同樣存在某種影響，目前國內外就此方面研究相對較少。本研究通過檢測miR-130b在RB組織中的表達水平并初步探討其可能性促癌機制，以期為RB的發生機制提供新的理論基礎，繼而為臨床治療開辟新思路。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1標本采集選取2013-07/2017-08期間在我院眼科中心接受眼球摘除術治療的RB患兒29例29眼，其中男16例16眼，女13例13眼；年齡3mo～6歲，平均2.5±0.8歲。所有患兒在入選本研究前均未接受過化療與局部放療。取每例患兒RB癌組織及相應癌旁組織(距腫瘤邊緣1～2cm范圍內組織)標本，每份標本均經我院病理科進行病理檢查確診。將收集到的標本放至液氮中保存待用。相關標本的收集程序、方法及后續各項實驗方案均已通過我院醫學倫理委員會審查，入選患兒家屬均簽署知情同意書。

1.1.2主要試劑和儀器主要試劑：人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homologuedeleted on chromosome 10，PTEN)過表達及對照、PTEN干擾及對照購自RiboBio公司；RNeasy Mini Kit(50)試劑盒購自MULTI SCIENCES公司、mRNA反轉錄試劑盒、miRNA反轉錄試劑盒購自美國Ferments公司；實時熒光定量PCR(qRT-PCR)試劑盒購自德國Qiagen公司；BCA蛋白定量試劑盒購自美國Pierce公司；Akt、p-Akt 308、p-Akt 473兔抗人多克隆抗體購自Bio-Rad公司；Triton X-100購自美國Dow Chemical公司；PTEN抗體購自英國Abcam公司；LipofectamineTM2000 Reagent購自美國Invitrogen公司。主要儀器：5% CO2培養箱371型購自Thermo Fisher公司；低溫超速離心機ALLEGRA X-15R型購自Beckman Coulter公司；倒置熒光顯微鏡Axio Observer A1/D1/Z1型購自德國Carl Zeiss公司；電泳儀、濕轉儀、搖床購自美國Bio-Rad公司；熒光定量PCR儀購自瑞士Roche公司。

1.2方法

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1.2.1細胞培養和轉染采用含10%胎牛血清的RMPI-1640與MCDB-131培養基分別于37℃、5% CO2恒溫培養箱內培養人RB細胞系HXO-Rb44與Y79(上海子實生物)及人正常視網膜血管內皮細胞系ACBRI-181(ATCC)。采用miR-130b mimics對HXO-Rb44細胞中的miR-130b進行過表達，對照物為miR-NC。采用anti-miR-130b對Y79細胞中的miR-130b進行下調處理，對照物為anti-miR-NC。分別采用miR-NC+PTEN-NC、miR-130b mimics+PTEN-NC、miR-NC+PTEN、miR-130b mimics+PTEN對HXO-Rb44細胞進行共轉染。分別采用anti-miR-NC+siSCR、miR-130b inhibitor+siSCR、anti-miR-NC+siPTEN、miR-130b inhibitor+siPTEN對Y79細胞進行共轉染。轉染后的細胞培養條件同前。

1.2.2qRT-PCR檢測參照試劑盒說明書提取總RNA(包括miRNA)，根據試劑盒操作說明檢測組織樣本及相關細胞系miR-130b表達水平，以U6小RNA為內參對照，采用2-△△Ct相對定量法處理數據。采用SYBR Green熒光定量PCR混合液與GAPDH為內參檢測PTEN基因的相對表達量，同時采用2-(Ct目的基因-Ct內參)計算PTEN靶基因的相對表達量。相關引物序列分別為：miR-130b(5’- CAGGCAAGAGAAAGGGCA -3’)；PTEN(5’-TGCAGATAATGACAAG-3’)；GAPDH(5’-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3’)；U6(5’-CTCGCTTCGGCAGCAC-3’)。

1.2.3WesternBlot檢測采用RIPA裂解緩沖液(含1% PMSF)裂解總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。蛋白煮沸變性，上樣40μg/孔。12% SDS-PAGE電泳分離，恒流條件下PVDF轉膜。采用含5%脫脂牛奶的TBST緩沖液在37℃條件下封閉2h。一抗(1∶1000)孵育，4℃過夜。TBST洗膜3次。二抗(1∶5000)孵育，37℃ 2h。TBST洗膜3次。最后采用ECL免疫印跡發光試劑盒進行檢測。

1.2.4免疫熒光染色分析重懸對數生長期細胞，調整密度約為1×105/mL，平皿(d=3.5cm)接種后于37℃、5% CO2恒溫培養箱內培養。細胞貼壁后去培養基，預溫PBS(37℃)清洗3次。采用10%甲醛固定40min，PBS清洗3次，每次10min。采用濃度為0.2% Triton X-100透化處理5min，清洗。采用5% BSA(500μL/孔)室溫封閉1h。加一抗(1∶100)，放置到濕盒內4℃過夜，復溫45min后采用PBS搖洗3次；加二抗(1∶400)，37℃避光放置30min，PBS搖洗3次。室溫條件下DAPI染色5～10min，去DAPI后采用PBS避光搖洗3次。最后進行熒光顯微鏡鏡檢。

1.2.5雙熒光素酶報告基因試驗合成序列miR-130b：3’-GGAAAGUAGUAACGUGA-5’，攜帶PTEN-3’非翻譯區(3’UTR)目的片段的質粒：野生型PTEN 3’UTR(PTEN 3’UTR WT)：5’-UCCUACCCCUUUGCACU-3’、突變型PTEN3’UTR(PTEN 3’UTR MUT)：5’-UCCUACCCCUUAGGAGU-3’。將后兩種序列分別構建到pmirGLO雙螢光素酶報告基因載體質粒上。取對數生長期HEK293T細胞，以每孔7.5×104個細胞接種于24孔板中，細胞培養箱培養1d。更換為無血清培養基。將miR-130b mimics及miR-130b control分別與PTEN的空質粒(PTEN-NC)、野生質粒(wt-PTEN)以及突變質粒(mut-PTEN)進行組合，共計6組，每組包括4個副孔。將100μL無血清培養基、2μL LipofectamineTM2000、20pmol RNA(1μL)、0.4μg質粒(4μL)等物質加至EP管內并配勻，室溫靜置20min再分別加至相應孔板。根據雙熒光素酶檢測試劑盒說明書，48h后加20μL PLB裂解液，裂解后加到96孔板，加100μL熒光素酶檢測試劑Ⅱ(luciferase assay reagentⅡ，LARⅡ)后進行螢火蟲熒光酶活性檢測。最后加100μL Stop & Glo?試劑湮滅螢火蟲熒光素酶活性并激活海腎熒光素酶活性，檢測miR-130b mimics+wt-PTEN與miR-130b mimics+mut-PTEN組的螢火蟲熒光素酶活性改變情況。

圖1qRT-PCR檢測miR-130b在人RB癌組織和癌旁組織及人RB細胞系中的表達A：miR-130b在人RB癌組織與癌旁組織中的表達(aP<0.05vs癌旁組織)；B：miR-130b在ACBRI-181、HXO-Rb44、Y79三種細胞系中的表達(aP<0.05vsACBRI-181)；C：miR-130b在經miR-130b mimics轉染后的HXO-Rb44細胞中的表達(aP<0.05vsHXO-Rb44)；D：miR-130b在經miR-130b inhibitor轉染后的Y79細胞中的表達(aP<0.05vsY79)。

圖2PTEN在人RB癌組織和癌旁組織中的表達及其與miR-130b的相關性A：qRT-PCR檢測PTEN在人RB癌組織與癌旁組織中的表達(aP<0.05vsRB癌組織)；B：miR-130b表達與PTEN表達的相關性。

2結果

2.1miR-130b在人RB癌組織和癌旁組織及人RB細胞系中的表達miR-130b在人RB癌組織中的表達水平顯著高于癌旁組織(t=3.273，P=0.002，圖1A)。與ACBRI-181細胞比較，miR-130b在HXO-Rb44與Y79細胞中的表達水平顯著增高，其中miR-130b在Y79細胞中的表達水平最高(3組比較：F=549.619，P<0.001；ACBRI-181vsHXO-Rb44：t=-23.208，P<0.001；ACBRI-181vsY79：t=-32.109，P<0.001；HXO-Rb44vsY79：t=-8.901，P<0.001，圖1B)。HXO-Rb44細胞轉染miR-130b mimics后，miR-130b表達水平顯著增高(3組比較：F=1725.913，P<0.001；miR-NCvsHXO-Rb44：t=-0.489，P=0.626；HXO-Rb44vsmiHXO-Rb44：t=-51.124，P<0.001；miR-NCvsmiHXO-Rb44：t=-50.635，P<0.001，圖1C)。Y79細胞轉染miR-130b inhibitor后，miR-130b表達水平顯著降低(3組比較：F=1427.198，P<0.001；Y79vsanti-miR-NC：t=2.159，P=0.034；Y79vsinY79：t=47.307，P<0.001；anti-miR-NCvsinY79：t=45.148，P<0.001，圖1D)。

2.2PTEN為miR-130b的靶基因

2.2.1PTEN在人RB癌組織和癌旁組織中的表達及其與miR-130b的相關性與人RB癌組織比較，PTEN在其癌旁組織中的表達水平顯著增高(t=-4.329，P<0.001，圖2A)。相關性分析顯示，miR-130b表達水平與PTEN表達水平呈負相關性(r=-0.5608，P<0.001，圖2B)。

2.2.2PTEN在人RB細胞系中的表達Y79細胞中PTEN mRNA與蛋白的表達水平均顯著低于HXO-Rb44細胞(qRT-PCR檢測結果：t=-12.071，P<0.001，圖3A)。過表達miR-130b后的HXO-Rb44細胞中PTEN mRNA與蛋白表達水平均顯著降低，而干擾miR-130b后的Y79細胞PTEN mRNA與蛋白表達水平均顯著升高(qRT-PCR檢測結果：miR-NCvsmiHXO-Rb44：t=7.951，P<0.001；anti-miR-NCvsinY79：t=9.588，P<0.001，圖3B、C)。

圖3PTEN在人RB細胞系中的表達A：qRT-PCR和Western Blot法檢測HXO-Rb44與Y79細胞中的PTEN表達(aP<0.05vsHXO-Rb44)；B：qRT-PCR和Western Blot法檢測轉染后HXO-Rb44與Y79細胞中的PTEN表達(aP<0.05vsmiR-NC;cP<0.05vsanti-miR-NC)；C：免疫熒光法檢測HXO-Rb44和Y79細胞中PTEN表達(×400)。

圖4雙熒光素酶報告基因試驗結果aP<0.05vsmiR-130b mimics+PTEN-NC。

圖5WesternBlot法檢測miR-130b對RB細胞系PI3K/Akt信號通路表達的影響A：過表達miR-130b對HXO-Rb44細胞PI3K/Akt信號通路表達的影響(aP<0.05vsmiR-NC)；B：下調miR-130b對Y79細胞PI3K/Akt信號通路表達的影響(aP<0.05vsanti-miR-NC)。

2.2.3雙熒光素酶報告基因試驗結果與miR-130b mimics+PTEN-NC組比較，miR-130b mimics+wt-PTEN的螢火蟲熒光素酶活性大幅度降低(t=7.298，P<0.001)，但miR-130b mimics+mut-PTEN組未發生明顯改變(t=0.228，P=0.820，圖4)。

2.3miR-130b對RB細胞系PI3K/Akt信號通路表達的影響過表達miR-130b后的HXO-Rb44細胞p-Akt 308、p-Akt 473蛋白的表達水平相較miR-NC組均顯著升高(t=-11.724、-9.225，均P<0.001)，總Akt蛋白表達水平無顯著差異(t=-0.773，P=0.443)，見圖5A。下調miR-130b后的Y79細胞p-Akt 308、p-Akt 473蛋白的表達水平相較anti-miR-NC組均顯著降低(t=14.260、10.821，均P<0.001)，總Akt蛋白表達水平無顯著差異(t=-1.317，P=0.193)，見圖5B。

2.4PTEN與miR-130b對RB細胞系PI3K/Akt信號通路表達的影響四種共轉染的HXO-Rb44細胞p-Akt 308、p-Akt 473、PTEN蛋白表達水平有明顯差異(F=83.043、62.943、111.091，均P<0.001)，總Akt蛋白表達水平無明顯差異(F=0.978，P=0.406)；共轉染miR-130b mimics+PTEN-NC HXO-Rb44細胞p-Akt 308與p-Akt 473蛋白表達水平顯著增高(均P<0.05)，PTEN蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)；共轉染miR-130b mimics+PTEN HXO-Rb44細胞中，以上三種蛋白表達水平均未發生明顯改變(均P>0.05)，見圖6A。四種共轉染的Y79細胞p-Akt 308、p-Akt 473、PTEN蛋白表達水平有明顯差異(F=193.123、369.911、274.311，均P<0.001)，總Akt蛋白表達水平無明顯差異(F=0.568，P=0.637)；共轉染miR-130b inhibitor+siPTEN Y79細胞p-Akt 308與p-Akt 473蛋白的表達水平無明顯差異(308：t=0.244，P=0.808；473：t=-0.271，P=0.808)，圖6B。

3討論

RB是當前最為常見且危害程度最高的兒童眼內惡性腫瘤。隨著RB治療理念的進步，其國內治療發展趨勢正逐步朝發達國家靠攏，盡量避免行患眼眼球摘除術或眼眶內容物剜出術。常用的保守治療方法則主要包括放療、經瞳孔溫熱療法、化學減容療法以及激光光凝等，但各種保守療法均存在不足[7-8]。隨著分子生物學研究的深入，針對已明確的由腫瘤細胞內部某一個蛋白分子或基因片斷所形成的致癌位點開展分子靶向治療，為改善RB的整體臨床治療效果增加了可能性。

圖6WesternBlot法檢測PTEN與miR-130b對RB細胞系PI3K/Akt信號通路表達的影響A：PI3K/Akt信號通路相關蛋白在HXO-Rb44細胞中的表達；B：PI3K/Akt信號通路相關蛋白在Y79細胞中的表達。

miRNA是一類具有進化高度保守特征的小分子非編碼RNA，約含22個核苷酸，廣泛存在于動植物及某些病毒體內。成熟miRNA分子能與靶基因mRNA的3’UTR區域進行完全或不完全互補配對，繼而促使靶基因mRNA降解或阻滯蛋白表達[9]。miR-130b家族因被發現在某些癌癥中發揮重要作用而受到廣泛關注，該家族成員包括分別位于人染色體11q12.1與22q11.21上的miR-130a和miR-130b。其中miR-130b在不同類型腫瘤中的作用具有差異性，表現出類似原癌基因或抑癌基因的生物學功能[10]。研究發現，miR-130b在食道癌組織與胃癌組織中呈高表達，能促進腫瘤細胞的增殖與轉移或降低凋亡，可視為致癌基因[11-12]；在胰腺癌組織和細胞中呈異常低表達，能減少腫瘤細胞的增殖與轉移，可視為抑癌基因[3]。本研究經qRT-PCR檢測發現，miR-130b在RB癌組織中的表達水平顯著高于癌旁組織(P<0.05)，且其在RB細胞系中的表達水平較正常視網膜血管內皮細胞也顯著增高(P<0.05)。提示miR-130b在RB中可能發揮促癌作用，故研究miR-130b的靶基因有利于更加明確其在RB中的作用機制。

PTEN為一種位于染色體10q23區域的具有雙特異性磷酸酶活性的抑癌基因，研究發現多種惡性腫瘤的發生發展均與PTEN結構與功能異常具有密切關聯[13-14]。Meng等[15]在肝癌中首次證實了PTEN mRNA 3’UTR可直接與miR-21結合，繼而使PTEN的抑癌功能被抑制。之后陸續有研究發現在多種腫瘤組織中均有不同miRNA與PTEN靶向結合的情況[16-17]。可以認為在這些特定的腫瘤中，表達異常的miRNA參與了PTEN的表達調控。故本實驗選擇PTEN作為miR-130b在RB作用機制研究的準靶基因。基于靶基因預測的假陽性率普遍較高，本研究不僅考察了PTEN在HXO-Rb44細胞與Y79細胞中的表達水平以及與miR-130b表達的相關性，同時也采用了雙熒光素酶報告基因試驗進行證實，結果表明miR-130b表達水平與PTEN表達水平呈負相關性，miR-130b在基因水平與蛋白水平均可對PTEN的表達產生影響，且miR-130b可直接靶向結合PTEN mRNA 3’UTR。進一步機制則可能與Akt信號通路的激活有關。已有研究發現，miR-221/222與miR-22等miRNA分子均在靶向作用PTEN后繼而激活Akt信號通路產生促癌作用[16-17]。另一項關于膀胱癌的報道指出，PTEN為PI3K/Akt信號通路的負調節劑，可將PI3K/Akt通路的調節元件作為其潛在的治療靶點[18]。本研究結果顯示，在共轉染miR-130b mimics+PTEN-NC的HXO-Rb44細胞中，p-Akt 308與p-Akt 473蛋白表達水平顯著增高(P<0.05)，PTEN蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，而在共轉染miR-130b mimics+PTEN的HXO-Rb44細胞中，以上三種蛋白表達水平均未發生明顯改變。提示在RB中，miR-130b也可能是通過負向調控PTEN對PI3K/Akt信號通路的表達產生影響。

綜上所述，本研究發現miR-130b在RB組織及細胞系中呈高水平表達，miR-130b可能是經負向調控PTEN對PI3K/Akt信號通路的表達產生影響，最終發揮促癌作用。miR-130b有望成為RB基因治療的有效分子靶點。