小豆不定芽誘導及再生體系的建立

林建輝 陸玉建 張永磊 李震 朱麗暉 石東里

摘要：以小豆（Vigna angularis）下胚軸為外植體，分析影響小豆不定芽誘導及植株再生的因素，建立高效穩定的小豆離體再生體系。結果表明，小豆不定芽誘導最適培養基為MS+2.0 mg/L 6-BA;生根最適培養基為1/2MS+0.5 mg/L IBA。

關鍵詞：小豆（Vigna angularis）;胚軸;不定芽;生根;再生

中圖分類號：S521 ? ? ? ? 文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2019）24-0236-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.24.057 ? ? ? ? ? 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Adventitious buds induction of Vigna angularis and establishment of

the regeneration system

LIN Jian-hui，LU Yu-jian，ZHANG Yong-lei，LI Zhen，ZHU Li-hui，SHI Dong-li

（1.College of Biological and Environmental Engineering，Binzhou University/Shandong Provincial Engineering and Technology Research Center for Wild Plant Resources Development and Application of Yellow River Delta，Binzhou 256603，Shandong，China）

Abstract： In this study， the hypocotyls were used as explants to analyze the factors that affected the adventitious bud induction and plant regeneration of Vigna angularis. An attempt was made to establish an efficient and stable regeneration system of Vigna angularis. The results showed that the optimal medium for the induction of adventitious buds was MS+2.0 mg/L 6-BA， and the optimum medium for rooting was 1/2MS+0.5 mg/L IBA. By analyzing the factors affecting the regeneration of Vigna angularis in vitro.

Key words： Vigna angularis; hypocotyl; adventitious bud; rooting; regeneration

小豆（Vigna angularis）又名赤豆、紅豆、紅小豆，為豆科（Leguminosae）豇豆屬（Vigna）一年生草本植物，起源于中國，已有2 000多年的栽培歷史[1，2]。小豆營養價值豐富，富含多種氨基酸和維生素，蛋白質含量高、脂肪含量低，是理想的高蛋白、低脂肪食品[3]。小豆子粒鐵含量豐富，是傳統的補血食物[4]。此外，小豆中還含有較多的萜類、異黃酮、皂角甙等生物活性物質，具有較高的藥用價值[5]。小豆廣泛分布于全國各地，其耐瘠薄、抗干旱、適應性強，是逆境條件下優勢雜糧作物[6，7]。不同品種小豆對干旱脅迫的響應存在差異[8]，用PEG處理小豆幼苗，小豆葉片中 MDA和可溶性蛋白含量、SOD活性均發生明顯的變化[9]。缺Fe脅迫降低了小豆幼苗葉片的葉綠素含量及光合速率，增加了小豆幼苗根系呼吸速率及Fe3+還原酶活性[10]。利用現有種質資源，選育優質新品種已成為當前小豆研究的重點。隨著分子生物學的快速發展，基因工程技術已成為快速高效改良作物遺傳性狀的重要途徑。小豆再生體系建立是進行遺傳轉化的基礎，而關于小豆離體再生和遺傳轉化研究的報道較少。已有的研究表明，小豆的外植體不同、基因型不同，其離體再生能力和遺傳轉化條件也不盡相同[11-15]。

目前，小豆離體再生的頻率比較低，已成為制約小豆遺傳性狀快速改良的重要因素。本試驗以小豆胚軸為外植體，研究不同植物生長物質對小豆愈傷組織誘導和不定芽分化的影響，建立高效穩定的小豆離體再生體系，從而為下一步小豆遺傳轉化體系的建立和品質的改良奠定基礎。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

小豆種子由山東省黃河三角洲野生植物資源開發利用工程技術研究中心提供。

1.2 ?方法

1.2.1 ?培養基的配制

1）愈傷組織誘導和分化培養基。以MS為基本培養基，添加不同濃度的6-BA（2.0、3.0和5.0 mg/L）、NAA（0.2和0.5 mg/L）、IBA（0.2和0.5 mg/L）和TDZ（0.05和0.1 mg/L），調節pH到5.8（表1）。所有培養基均添加3%的蔗糖和1%的瓊脂。

2）生根培養基。以1/2MS為基本培養基，添加不同濃度的NAA（0.1和0.5 mg/L）和IBA（0.1和0.5 mg/L），調節pH到5.8（表2）。

1.2.2 ?種子的消毒和種植 ?選取子粒飽滿、種皮完好的小豆種子，自來水沖洗10 min后75%乙醇溶液浸泡30 s，0.1% HgCl2溶液處理10 min，無菌水沖洗5～6次，然后將種子接種到MS培養基中進行培養。小豆的生長條件為16 h光照/8 h黑暗，濕度保持在60%～70%，溫度25 ℃，光照度2 000 lx。

1.2.3 ?愈傷組織的誘導和分化 ?以生長5 d的小豆下胚軸為材料，切成約2 cm的小段，接種到HD1～HD9培養基中，進行愈傷組織誘導和不定芽的分化培養。2周繼代培養1次，30 d統計愈傷組織誘導率，分化出芽的數量和芽分化率。

愈傷組織誘導率=（產生愈傷組織的外植體數/接種數）×100%

不定芽分化率=（產生不定芽的外植體數/接種數）×100%

1.2.4 ?生根的誘導 ?當不定芽長度約3～5 cm時，切取生長良好的不定芽，接種于生根培養基R1～R4中進行生根誘導，2周后統計不定芽的生根率和根增殖系數。

生根率=（產生不根的外植體數/接種數）×100%

1.2.5 ?統計分析 ?采用EXCEL 2007和SPSS 19.0軟件對試驗數據進行統計分析及Duncan多重比較。顯著性測驗，字母相同者差異不顯著，字母不同者表示在0.05（小寫字母）或0.01（大寫字母）水平上差異顯著。

2 ?結果與分析

2.1 ?植物生長物質對外植體愈傷組織誘導的影響

將小豆下胚軸接種于HD1～HD9培養基中，30 d后統計愈傷組織誘導率。結果表明，上述培養基均可誘導外植體脫分化產生愈傷組織，但培養基中植物生長物質不同，愈傷組織誘導效果也存在明顯的差異（圖1A）。在HD1～HD4培養基中，小豆產生愈傷組織的量較少且易褐化，誘導率不足50%。愈傷組織誘導效果較好的是HD6～HD8，愈傷組織生長狀態較好，誘導率超過75%。其中，誘導效果最好的是HD7，愈傷組織誘導率達到90%，和其他培養基差異極顯著（P<0.01）。

2.2 ?植物生長物質對小豆不定芽誘導的影響

選取生長良好的愈傷組織，接種到HD1～HD9培養基中繼續培養，30 d可分化產生明顯的不定芽。結果表明，小豆在上述培養基中，植物生長物質明顯影響愈傷組織的分化（圖1B）。其中效果最差的是HD1，不定芽的分化率只有20%，幾乎觀察不到明顯的不定芽;其次是HD2～HD5，不定芽的分化率不到50%;愈傷組織分化不定芽效果較好的培養基為HD7～HD9，不定芽的分化率達到70%以上，不定芽的數量較多，生長情況較好。其中，HD7培養基中愈傷組織分化產生不定芽的效果最好，不定芽分化率達到90%，不定芽數量多且生長旺盛，和其他培養基差異極顯著（P<0.01）。

2.3 ?植物生長物質對小豆不定芽生根的影響

將小豆不定芽接種到HR1～HR4培養基中，2周后統計不定芽生根率。結果表明，小豆比較容易生根，這4種培養基都可誘導不定芽生根，但植物生長物質不同，生根的效果不同（圖1C和圖1D）。在HR1和HR2培養基中，不定芽基部產生的根長而勻稱;HR3和HR4培養基誘導產生的根短而細小。在HR1培養基中，不定芽生根率大約為60%，數量較少;在HR2培養基中，不定芽生根率最高，達到90%以上，數量較多，根系發達。小豆不定芽在HR3培養基中生根率雖高于HR1培養基，但效果不及HR2培養基，且主根數量較少，根系不發達;在HR4培養基中，不定芽生根率較高，數量較多，接近HR2培養基，但根生長有些異常，許多根向上生長。

2.4 ?小豆離體再生體系的建立

選取顆粒飽滿的小豆種子（圖2A），消毒后接種于MS培養基中進行培養。小豆種子萌發較快，4～5 d后即可生長為高度適中小豆幼苗（圖2B）。切取長度適宜的下胚軸，接種到HD7培養基中（圖2C）。7 d后胚軸頂端細胞開始脫分化產生愈傷組織（圖2D）。繼續培養14 d后，可觀察到有大量的愈傷組織生成，結構致密，呈淡綠色（圖2E）。取生長狀態較好的愈傷組織，接種到HD7培養基中進行繼代培養，愈傷組織急劇增多（圖2F）。14 d進行一次繼代，部分愈傷組織開始再分化產生不定芽（圖2G）。愈傷組織連續繼代培養，約30 d后可產生明顯的不定芽，但數量較少（圖2H）。將分化產生不定芽的愈傷組織繼續進行分化培養，愈傷組織體積顯著增大，表面產生大量的不定芽，成簇分布，形成叢生芽（圖2I），其中結構致密的顆粒狀愈傷組織比較適合不定芽的分化培養（圖2J）。繼續培養至49 d，不定芽逐漸長高，數量不斷增多，生長比較旺盛（圖2K）。培養60 d后，多數不定芽高度比較適中，可以進行生根誘導（圖2L）。不定芽再繼續培養至70 d，雖然不定芽仍能繼續生長，但部分不定芽開始發黃枯萎，生長狀態不佳（圖2M）。

不定芽連續繼代培養約60 d后，選取長度3～5 cm生長健壯的不定芽，接種到HR2生根培養基中進行生根誘導（圖2N）。不定芽生根較快，7 d后基部開始長出不定根，此時數量較少，長度較短。14 d后產生明顯的根，繼續培養21 d后，根的數量顯著增多，根系較為發達，不定芽繼續生長，不斷產生新枝新葉，進而獲得試管苗（圖2O和圖2P）。

3 ?討論

小豆在中國種植歷史悠久，具有較高的食用價值和藥用價值[4，5]。目前，有關小豆的研究還較少，高效的離體再生體系尚未建立，制約了轉基因技術在小豆作物遺傳改良中的應用。本研究以小豆胚軸為外植體，分析影響小豆不定芽誘導和植株再生的因素，初步建立起高效穩定的小豆離體再生體系。在適宜的培養條件下，小豆下胚軸誘導14 d后產生明顯的愈傷組織;愈傷組織繼代培養14 d，愈傷組織繼續生長，開始產生芽點;繼代培養14 d后產生明顯的芽。生根誘導7 d不定芽開始生根，14 d產生明顯的根。試驗結果表明，影響小豆愈傷組織誘導和分化的最主要因素是6-BA的濃度。當培養基中添加6-BA時，無論是否加入其他植物生長物質，下胚軸均可誘導產生愈傷組織并分化出不定芽。加入NAA、IBA或TDZ，對小豆愈傷組織誘導和不定芽分化不僅沒有明顯的促進作用，反而還顯示出一定程度的抑制作用，抑制效果的強弱和這些成分的濃度有關。在HD7培養基中，外植體產生愈傷組織和不定芽的效果最好，不僅愈傷組織結構致密，生長旺盛，不易褐化，而且再分化產生不定芽數量較多，這與劉紅霞[11]的研究結果一致。小豆基因型也是影響小豆離體再生的重要因素，本研究所采用的小豆品種，在最適條件下，愈傷組織誘導率和不定芽分化率均達到90%以上。生根結果表明，以1/2MS為基本培養基，添加不同濃度的NAA和IBA，均可促進不定芽生根。其中HR2培養基最適合生根，不定芽生根率最高，達到90%以上，數量較多，根系發達。對于小豆而言，與NAA相比，一定濃度的IBA更適合不定芽的生根誘導。本研究通過探索小豆離體快繁的最適條件，初步建立起比較高效穩定的小豆離體再生體系，從而為下一步小豆遺傳轉化體系的建立和生物性狀的改良奠定基礎。

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