夏天無配方顆粒特征圖譜研究△

金輝輝，徐斌，黃妍，童玉華，薛瑾，王昕佳，姚建標*

1.浙江康恩貝制藥股份有限公司，浙江 杭州 310052；2.浙江省中藥制藥技術重點實驗室，浙江 杭州 310052；3.浙江中醫藥大學，浙江 杭州 310052；4.江西天施康中藥股份有限公司，江西 鷹潭 335000

夏天無為罌粟科植物伏生紫堇Corydalisdecumbens(Thunb.)Pers.的干燥塊莖，分布于浙江、江西、江蘇、安徽、湖北、河南等地區，為國家地理標志保護產品[1]。主要化學成分為生物堿類，此外還含有機酸類、淀粉、鞣質等[2-3]。夏天無具行氣活血，通絡止痛之功效，文獻報道其對心血管系統、消化系統、內分泌系統等具有明顯的藥理作用[4-11]，為民間常用草藥，常用于治療高血壓、中風偏癱癥、風濕性關節炎及腰肌勞損等，通常研末沖服、煎湯內服[12]。

夏天無配方顆粒是夏天無飲片經現代提取技術及制劑工藝精制而成，在臨床上可以替代夏天無飲片，因此對其研究有著十分積極的意義。原阿片堿與鹽酸巴馬汀為夏天無的特征性成分，同時也是其主要有效成分。本研究參照《中藥配方顆粒管理暫行規定》制備配方顆粒，以此為基礎，建立了夏天無配方顆粒的特征圖譜方法，確定了10個共有特征峰，為夏天無配方顆粒的質量控制及工藝研究提供了參考。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀、Agilent1260高效液相色譜儀串聯質譜Q-TOF 6530A；Sartorius BS 201S 電子天平(北京賽多利斯儀器有限公司)；DK-S26 水浴鍋(上海精宏)；KQ-250DB 數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥

原阿片堿(中國食品藥品檢定研究院，批號：110853-201404，純度：99.7%)；鹽酸巴馬汀(中國食品藥品檢定研究院，批號：110732-201611，純度：86.8%)；延胡索乙素(中國食品藥品檢定研究院，批號：110726-201516，純度：99.8%)；D-四氫藥根堿(上海源葉生物科技有限公司，批號：M30J8S38887，純度≥98%)；比枯枯靈(成都普菲德生物有限公司，批號：150917，純度≥98%)。

夏天無藥材由金華市益康醫藥有限公司和江西天施康中藥股份有限公司提供，由浙江康恩貝制藥股份有限公司炮制。經浙江康恩貝制藥股份有限公司何厚洪高級工程師鑒定均為正品。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相：以乙腈為流動相A，以三乙胺醋酸溶液(三乙胺8 mL，冰醋酸30 mL，加純水稀釋至1000 mL)為流動相B，梯度洗脫(0～15 min，13%A；15～20 min，13%～17%A；20～30 min，17%A；30～50 min，17%～24%A；50～55 min，24%～36%A；55～60 min，36%～95%A)；檢測波長：285 nm；流速：1 mL min-1，柱溫：40 ℃，進樣量：10 μL。

2.2 夏天無配方顆粒的制備

參照《中藥配方顆粒管理暫行規定》，以9批夏天無飲片為源頭，最終制得15批夏天無配方顆粒。制備工藝：取夏天無飲片，加水煎煮3次，每次1 h，加水量依次為6倍、6倍、6倍，濾液濃縮至相對密度約至1.05～1.10(60 ℃)，干燥，粉碎，加糊精適量，混勻，制粒，即得夏天無配方顆粒。

2.3 對照品溶液和供試品溶液的制備

2.3.1 對照品溶液制備方法 精密稱取延胡索乙素、原阿片堿、鹽酸巴馬汀、D-四氫藥根堿適量，加甲醇稀釋成每1 mL含延胡索乙素50 μg，原阿片堿30 μg，鹽酸巴馬汀10 μg，D-四氫藥根堿50 μg的混合對照品溶液。

2.3.2 供試品溶液的制備 取夏天無配方顆粒1 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入氨水1 mL潤濕，再精密加入甲醇30 mL，稱定質量，超聲提取40 min，放冷，再次稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，過濾，濾液蒸干，殘渣加甲醇溶解，轉移至10 mL量瓶中并定容至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.3.3 陰性供試品溶液的制備 取糊精，按2.3.2項下方法，制備陰性供試品溶液。

2.4 方法學驗證

2.4.1專屬性考察 取延胡索乙素、原阿片堿、鹽酸巴馬汀、D-四氫藥根堿混合對照品溶液、夏天無配方顆粒供試品溶液和陰性供試品溶液按2.1項下方法進樣檢測，陰性供試品溶液無干擾，供試品溶液中色譜峰分離良好，見圖1。方法專屬性良好。

注：A.空白溶液；B.混合對照品溶液；C.夏天無配方顆粒供試品溶液。圖1 夏天無配方顆粒專屬性考察

2.4.2 精密度試驗 按2.3.2項下方法制備供試品溶液，重復進樣5次，各共有峰相對保留時間的RSD均<0.18%，儀器精密度良好。

2.4.3 穩定性試驗 按2.3.2項下方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12、24 h進樣測定，各共有峰相對保留時間的RSD均<0.35%。供試品溶液在24 h內穩定。

2.4.4 重復性試驗 取同一批號樣品，按2.3.2項下方法制備6份，各共有峰相對保留時間的RSD均<0.31%。該方法重復性良好。

2.5 特征峰的確定及對照指紋圖譜的生成

按2.3.2項下方法，制備15批夏天無配方顆粒供試品溶液，按2.1項色譜條件測定，記錄色譜圖。通過HPLC特征圖譜選取了10個共有峰作為特征峰，建立了夏天無配方顆粒的對照特征圖譜，見圖2。其中峰5為原阿片堿，該色譜峰峰形尖銳穩定，分離良好，且為夏天無藥材中重要質量控制指標成分，故確定原阿片堿為參照峰(S峰)。

2.6 相對保留時間的確定

通過15批夏天無配方顆粒的HPLC圖，生產對照指紋圖譜(見圖3)，同時記錄各共有峰的保留時間，計算相對于S峰的保留時間值(見表1)。各峰的平均相對保留時間值分別為0.190(峰1)、0.287(峰2)、0.827(峰3)、0.952(峰4)、1(S)、1.255(峰6)、1.335(峰7)、1.396(峰8)、1.449(峰9)、1.836(峰10)；RSD分別為0.404%、0.668%、0.233%、0.229%、0%、0.206%、0.361%、0.198%、0.205%、0.243%；將各峰平均相對保留時間值定為特征圖譜規定值，檢測相對保留時間應在規定值的±5%以內。

2.7 特征圖譜峰定性

按2.3.2項下方法制備供試品溶液，進行質譜分析。提取峰4、5、9、10成分的二級質譜圖進行解析[13]，再結合對照品分析，確定其結構。

3 討論

本實驗對不同廠家不同型號色譜柱進行考察：色譜柱1：(Welch Xtimate?C185-Micron 250 mm×4.6 mm，Part Number：00101-21043，Serial Number：411501757)、色譜柱2：(Welch Utimate?XB-C185-Micron 250 mm×4.6 mm，Part Number：2101.78，Serial Number：211303178)、色譜柱3：(Aglient ZORBAX SB-C185-Micron 250 mm×4.6 mm，Part Number：880975-902，Serial Number：USCL067039)，色譜柱4：(Athena C18120?5-Micron 250 mm×4.6 mm，Part Number：LAEQ-462571，Serial Number：T9370008)。結果顯示，Aglient SB-C18、Athena C18色譜柱檢測得到的色譜圖相對分離度更佳，峰形更為尖銳，且峰更多，能更全面表達色譜信息，更適宜做特征圖譜，建議用Aglient SB-C18與Athena C18色譜柱。

注：4.D-四氫藥根堿；5.原阿片堿；9.延胡索乙素；10.鹽酸巴馬汀。圖2 夏天無配方顆粒對照特征圖譜

表1 15批夏天無配方顆粒特征圖譜測定結果

圖3 15批夏天無配方顆粒特征圖譜

本實驗對色譜柱溫度(20、25、30、35、40 ℃)進行考察。發現溫度對色譜圖分離和峰形影響較大，溫度越高峰形越尖銳，分離度也有提高，因此確定40 ℃為最佳柱溫。

在供試品溶液制備時，考察了不同提取溶劑體系(甲醇-氨水、三氯甲烷-甲醇-氨水、三氯甲烷-氨水)，結果顯示，三氯甲烷-氨水提取體系有部分峰丟失，三氯甲烷-甲醇-氨水提取體系在0～10 min內雜峰比較少。但考慮到三氯甲烷為有毒試劑，標準湯劑為純水提取，且結合色譜圖峰的分離情況，最終選擇甲醇-氨水體系。

圖4 特征圖譜色譜峰定性

4 結論

中藥材本身成分復雜，中醫藥理論強調其多成分的整體性，中藥特征圖譜在質量評價中起著尤為重要的作用。本實驗建立了夏天無配方顆粒的特征圖譜來監測整體質量，驗證了方法穩定性、重復性等，確立了10個特征峰；并利用對照品和液相色譜-質譜聯用技術(LC-MS)對其特征圖譜特征峰進行了定性，為夏天無配方顆粒的工藝研究及質量控制提供了參考。