香煙煙霧對卵巢顆粒細胞的影響*

周洋 章帆 徐湛湛 孫琦 應居正 徐營

(嘉興學院醫學院，浙江 嘉興 314001)

在生活中人類接觸香煙煙霧的機會巨大，據報道，香煙煙霧中有超過5000種的化合物，已經確定的致癌化合物多達60種，主要包括多環芳烴(如苯并芘)、亞硝胺和芳香胺等[1]。有研究表明，香煙煙霧中的這些有害物質可引起顆粒細胞中一些基因表達的變化，使卵巢內顆粒細胞發生凋亡，并且凋亡的發生與線粒體的功能變化密切相關。

1 香煙煙霧對女性生殖影響的現狀

盡管目前全球成年女性吸煙人數低于男性，但多數國家女性吸煙人數表現出上升趨勢，即使不吸煙，女性暴露于香煙煙霧的危險亦不容忽視。我國女性被動吸煙人數巨大，大多數女性都有不同程度香煙煙霧接觸史，且人數遠高于發達國家水平[2]。有流行病學研究顯示長期暴露于香煙煙霧中，女性的卵巢結構和功能會發生變化，生殖能力會受到影響。Mohammad等對此進行了研究，證明了香煙煙霧暴露能夠對女性生殖能力造成損傷[3]。香煙中含有焦油、煙堿、CO、醛類等有害的物質，可通過氧化等機制對女性卵巢產生傷害。有研究將關注點聚焦于顆粒細胞，發現這些有害物質使卵泡中顆粒細胞的自噬小體增加，顆粒細胞自噬作用增強，導致卵泡數量減少，卵泡成熟率降低，進而卵巢質量下降，影響女性生殖能力[3]。

2 香煙煙霧對卵巢顆粒細胞和卵母細胞間作用的影響

卵母細胞由卵原細胞發育而來，出生后的女性卵巢卵母細胞經歷了初級卵母細胞和次級卵母細胞階段，其發生與發育的基本單位為卵泡。在正常生理功能下，顆粒細胞和卵母細胞處于同一個微環境中，顆粒細胞由卵泡細胞發育而來，且隨著卵母細胞發育，顆粒細胞能夠分化出卵丘細胞和顆粒細胞，卵母細胞在兩種細胞作用下發育生長[4]。卵丘細胞主要起著支持卵母細胞發育的作用，并提供能量給卵母細胞。同時，卵丘細胞還參與調控了卵泡成熟的變化過程。顆粒細胞能夠分泌促卵泡刺激素(Follicule-stimulating hormone，FSH)受體和黃體生成素(Luteinizing hormone，LH)受體等多種激素受體，同樣能夠作用于卵母細胞。不僅如此，顆粒細胞和卵母細胞間存在著旁分泌和間隙連接[5]，在生理情況下，兩者相互影響。香煙煙霧中含有醛類等有害物質，能活化顆粒細胞內多種酶，產生內源性ROS，而使顆粒細胞內氧化增強，造成線粒體在氧化作用下損傷[6]。線粒體產能減少，獲得能量不足，使顆粒細胞功能受損。香煙煙霧亦能通過影響mfn1/2和PARKIN表達破壞線粒體。在香煙煙霧提取物作用下mfn1/2表達下降，線粒體融合障礙，線粒體功能結構破壞[7]；PARKIN表達升高，主要通過增強自噬作用使線粒體和顆粒細胞受損[8]。

同時顆粒細胞能夠產生生長因子，通過顆粒細胞和卵母細胞間的細胞連接，將其包含的信息傳遞給卵母細胞。當顆粒細胞功能受損，顆粒細胞產生的生長因子減少，對卵母細胞作用減弱，顆粒細胞傳遞給卵母細胞的信息減少[9]，使卵母細胞發育和功能下降，從而對女性的生育功能產生影響。香煙煙霧水溶物亦能直接影響顆粒細胞和卵母細胞間的細胞連接。長期暴露于香煙煙霧水溶物中，香煙中的尼古丁等成分可以進入顆粒細胞和卵母細胞的細胞連接中，同樣使顆粒細胞與卵母細胞信息傳遞減少，造成卵母細胞發育受到抑制和卵泡細胞減數分裂混亂[10]。

3 香煙煙霧對顆粒細胞生長因子表達的影響

正常情況下，顆粒細胞能分泌相關因子如抑制素(Inhibin，INH)、雌二醇(Estradiol，E2)、胰島素樣生長因子(Insulin like growth factor，IGF)等，對卵泡生長和發育起調節作用。香煙煙霧水溶物通過氧化損傷和影響PINK1/PARKIN和mfn1/2基因的表達，造成顆粒細胞功能下降，顆粒細胞表達產生的INH、E2和IGF減少，使卵母細胞發育受影響，從而使生殖能力下降。

香煙煙霧水溶物使顆粒細胞中抑制素α亞基基因表達產生的INH減少，通過負反饋抑制使FSH分泌下降。同時在卵巢上存在激活素受體，抑制素在多糖的作用下，通過細胞表面的TGF-β超家族與激活素相互作用，與激活素競爭結合激活素受體，使激活素的活化作用減弱。由于在正常卵巢中，激活素能夠促進下丘腦釋放促性腺激素釋放激素，垂體促卵泡激素生成，當激活素活化受抑制，FSH合成減少。香煙煙霧水溶物通過影響FSH合成，使卵泡的發育受阻[11]。

雌二醇(Estradiol，E2)能促進顆粒細胞卵泡刺激素受體的表達，同時抑制顆粒細胞凋亡。香煙煙霧水溶物使雌二醇產生減少，雌二醇的作用靶點之一為顆粒細胞，其使顆粒細胞細胞膜上卵泡刺激素受體的表達減少，抑制顆粒細胞凋亡作用減弱，造成顆粒細胞凋亡[12]。

胰島素樣生長因子(Insulin like growth factor，IGF)能促進細胞存活和增殖，亦能使細胞凋亡能力減弱。在竇前卵泡和竇卵泡的顆粒細胞中IGF-1生長因子量較高，香煙煙霧水溶物使IGF表達減少，使顆粒細胞凋亡能力增強，卵泡發育受到抑制。同時有研究表明FSH和雌二醇能夠促進IGF-1的合成[12]，香煙煙霧水溶物可以通過減少抑制素、雌二醇分泌，降低IGF-1的合成，影響卵泡的發育。

4 香煙煙霧對顆粒細胞線粒體的影響

研究表明，香煙煙霧水溶物使顆粒細胞內線粒體數量減少，結構呈空泡狀改變，嵴退行性變，內質網形態變異，該變化主要影響PARKIN和mfn1/2基因表達的變化，通過線粒體影響顆粒細胞結構和功能，導致旁分泌產生的生長因子減少，以及對卵母細胞信息傳遞減弱，影響女性生育能力[13～14]。

4.1 香煙煙霧線粒體數量結構的影響

線粒體是一種存在于細胞中的由兩層膜包被的細胞器，其基質內含有和細胞呼吸代謝相關的酶，能產生供細胞生理活動所需要的ATP，為細胞生命活動直接提供能量，在新陳代謝旺盛的細胞中線粒體居多。正常情況下，卵巢生理活動活躍需要大量的能量，所以在正常顆粒細胞中包含了大量的線粒體。香煙煙霧水溶物引起卵巢早衰時，細胞代謝減弱，所需能量減少，在顆粒細胞中mfn1/2表達下降，PARKIN表達升高后，引起線粒體自噬，線粒體數量減少，進而可通過觀察線粒體數目了解香煙煙霧對顆粒細胞的影響，進一步可見其對卵巢生理活動的影響。在計數線粒體數目時，由于每個線粒體中含有1-2套mt DNA，所以可以利用 mt DNA的數量來估計線粒體的數量[15]。當線粒體數量減少，顆粒細胞能量不足，而造成顆粒細胞功能下降。

線粒體結構由外向內分為四層結構，外膜光滑，內膜向內褶皺可形成線粒體嵴。在年輕的顆粒細胞線粒體中具有完整的管狀嵴，在年老的顆粒細胞中線粒體則表現為空泡狀，嵴和基質發生退行性變化或消失，出現電子致密物，線粒體發生破裂。通過電鏡觀察和IBAS圖像分析儀研究表明，長期接觸香煙煙霧水溶物，引起線粒體腫脹變形，嵴不完整甚至消失，線粒體表現出空泡化且膜發生破裂[16～17]，香煙煙霧中存在尼古丁，芳香胺類等物質，會引起線粒體氧化損傷和激活凋亡途徑，并且這種損傷程度隨著香煙煙霧水溶物濃度的增大而增加。同時香煙煙霧水溶物能使卵巢顆粒細胞中的自噬體增加，線粒體在自噬體的作用下受損[18]，使線粒體形態數量改變。香煙煙霧水溶物通過這幾種機制共同影響線粒體形態，使線粒體功能下降，產能減少，影響顆粒細胞功能。

4.2 香煙煙霧對mfn1/2表達的影響

在顆粒細胞內有線粒體融合蛋白1和線粒體融合蛋白2兩種亞型，它們分別由mfn1和mfn2基因編碼，均勻位于線粒體外膜，兩者在N末端有GTP酶結構域，C末端有跨膜區，該特殊結構能促進線粒體融合蛋白1和線粒體融合蛋白2與線粒體外膜結合，它們對觸發線粒體融合起重要作用[7]。

mfn1/2在顆粒細胞中可以通過調控顆粒細胞體內線粒體融合蛋白-1和融合蛋白-2的表達影響細胞的能量代謝[19]。香煙煙霧水溶物造成mfn1/2基因表達下降時，引起線粒體膜電位降低，影響線粒體呼吸鏈復合體亞單位結構及相關酶活性，使顆粒細胞有氧代謝減弱，使細胞由原來的糖攝取轉為糖酵解和糖原合成率降低[20]，細胞供能不足，功能受損。

mfn1/2在顆粒細胞中不僅影響著顆粒細胞能量代謝，同時保持線粒體的正常結構。mfn1/2表達產生的線粒體融合蛋白1和線粒體融合蛋白2能夠維持線粒體正常的三位網狀結構，長期暴露于香煙煙霧水溶物后，mfn1和mfn2基因表達下降，會使線粒體出現膜分裂，導致線粒體由正常的管狀連接膜網絡結構分裂成小球大泡狀膜結構[21]，并且出現沒有規律的布朗運動，而使線粒體功能障礙。

mfn1和mfn2不僅在線粒體外膜上表達，同時還在內質網膜上表達。在線粒體外膜或內質網上，線粒體融合2蛋白1和線粒體融合蛋白2可以聚合形成異源二聚體或者線粒體融合蛋白2自我形成同源二聚體，在兩者的作用下，介導著內質網和線粒體間的相互作用[22]。長期暴露于香煙煙霧水溶物后，線粒體和內質網上的二聚體形成減少，使線粒體和內質網結合力下降，形態發生改變，線粒體代謝減弱。內質網和線粒體共同影響卵巢顆粒細胞功能，進而影響卵母細胞發育和成熟。

4.3 香煙煙霧對PARKIN表達的影響

PARKIN是由Parkin2基因編碼的蛋白質，主要分布在細胞質中，這種蛋白質具有E3泛素-蛋白連接酶活性，能通過泛素-蛋白酶系統來降解細胞內異常的折疊蛋白，調節細胞生理功能，發揮保護作用[23]，同時能通過PINK1-PARKIN信號通路[24]，協調控制線粒體的自噬發生[25]。線粒體自噬是一種選擇性清除失用線粒體的自噬過程，調節著細胞內線粒體數量和正常功能，影響著機體內的多種生理過程，該自噬過程主要由Atg基因調節[26]。

在正常情況下，Parkin2基因表達較低，線粒體自噬發生障礙，當長期暴露于香煙煙霧水溶物后，Parkin2基因表達增加，通過PINK1-PARKIN信號通路誘導線粒體自噬體產生，降解被香煙煙霧水溶物氧化損傷的線粒體，使其功能下降而影響顆粒細胞功能，進而減弱旁分泌對卵母細胞的作用，使與卵母細胞之間的信息傳遞障礙造成卵母細胞功能變化。在該通路中PARKIN中必須依賴PINK1轉移到線粒體，才能發揮PARKIN的自噬作用[8]。

PARKIN除了通過自噬影響線粒體形態功能外，還能磷酸化線粒體融合蛋白。香煙煙霧水溶物通過影響氧化應激，能使線粒體功能障礙、基因完整性受損、膜電位下降，促使PARKIN聚集到受損傷的線粒體上。PARKIN在線粒體上使融合蛋白2泛素化[27]，泛素化修飾的mfn2能抑制線粒體融合，mfn2在香煙煙霧水溶物誘導下被PARKIN泛素化，可造成線粒體的融合障礙，線粒體碎片化，受損傷的線粒體單獨存在，引起線粒體的功能障礙。香煙煙霧水溶物引起的mfn2泛素化和線粒體碎片化同樣也能增強線粒體的自噬作用，導致線粒體數量、結構的改變[28]。線粒體功能下降，顆粒細胞獲能不足，同樣能降低顆粒細胞功能，影響卵母細胞發育和成熟進而對女性生殖能力造成不利影響。

5 展望

已有研究表明，香煙煙霧能夠減少mfn1/2表達和增加PARKIN表達，通過影響線粒體間融合和自噬機制而損傷線粒體的結構和功能[16,17,29]，間接使顆粒細胞受損；同時香煙煙霧也可減少顆粒細胞生長因子的分泌[11,12]，在兩種機制作用下通過影響顆粒細胞功能而造成卵母細胞受損，共同作用使女性卵巢功能受影響。

近年來由于香煙煙霧暴露于女性機會增加，國內外學者對此影響進行了一定的實驗研究，但是對香煙煙霧水溶物與卵巢顆粒細胞中相關基因表達影響的研究仍然不夠深入，仍值得進一步研究。研究香煙煙霧水溶物對卵巢顆粒細胞的影響，對女性的生殖意義重大，能為女性不孕和女性的卵巢早衰研究提供理論依據。