lncRNA及其在胃癌發生發展中的作用和機制研究進展

李璠，李強，姚瑋，王玉平，關泉林，周永寧

(蘭州大學第一醫院，蘭州 730000)

胃癌作為全球發病率排名第四、病死率排名第二的惡性腫瘤[1]，嚴重影響人們健康水平與生活質量。胃癌在我國高發，病死率較高，現已成為我國人群的第二大死因[1]。胃癌患者早期癥狀并不明顯，確診時約80%為進展期，術后五年存活率低于25%，診斷延誤成為現階段影響胃癌治療及預后的最大障礙。胃鏡與活組織檢查相結合仍是現階段全球惟一公認確診胃癌的金標準[2, 3]，但由于其有創性且經濟費用較高等原因不易被患者所接受，在胃癌篩查中應用受限。目前臨床最常用的腫瘤標志物由于診斷特異度與靈敏度不高而不能完全取代活組織檢查。長鏈非編碼RNA(lncRNA)可在人體的組織、血液及唾液等體液中直接獲取，且采集方便易被患者接受，具有較高的靈敏度及特異度，因此lncRNA可作為潛在的胃癌診斷腫瘤標志物。現就lncRNA及其在胃癌發生發展中的作用和機制研究進展綜述如下。

1 lncRNA的特點、分類及作用模式

lncRNA是長度>200 nt且不具有蛋白質編碼功能的RNA，在人類基因組中占比>90%，而僅有不足2%的基因具有蛋白編碼功能,缺少開放閱讀框，主要由RNA聚合酶Ⅱ合成。

lncRNA具有以下特點：表觀遺傳標記與內在轉錄基因相一致；表達具有組織特異性；參與多聚腺苷酸化；由特定的轉錄因子所調控[4]，有較強的組織特異性。ENCODE采用RNA-Seq對六株不同的細胞系進行分析比較發現，lncRNA主要分布于細胞核中[5]，Ma等[6]同時對不同類別的三種lncRNA在細胞內的分布分析發現,研究對象均在細胞核中含量豐富。lncRNA之前一直被歸為"基因噪音"，否認lncRNA在基因編碼過程中可發揮生物學功能。但近年來研究表明,lncRNA可通過調節轉錄、表觀遺傳等過程對基因表達的調控發揮重要作用[5],lncRNA通過影響DNA、蛋白質的合成及RNA反轉錄，從而調控剪切、染色體重構及mRNA降解等生物過程對基因表達進行調控[7]。

對lncRNA分類目前尚無統一標準，現階段使用較多的分類方法是根據與編碼基因間的相對位置關系將lncRNA主要分為五種類型。①基因間lncRNA：由兩個基因間的區域轉錄產生；②基因內lncRNA：由基因內的內含子區域轉錄產生；③正義lncRNA：由蛋白編碼基因的正義鏈轉錄產生，且轉錄方向與蛋白編碼基因的轉錄方向相同；③反義lncRNA：由蛋白編碼基因的反義鏈轉錄產生，轉錄方向與蛋白編碼基因轉錄方向相反；⑤雙向lncRNA：與相鄰蛋白編碼基因相同及相反兩個方向開始轉錄[8]。

lncRNA通過四類作用模式：信號、誘餌、導向、腳手架分子從而發揮對信號通路及轉錄因子等的調節功能，影響lncRNA在表觀遺傳、轉錄、轉錄后水平調控基因表達、染色質修飾、基因組印記、轉錄激活與抑制等多個過程。①信號作用模式：lncRNA可通過影響分子信號通路及轉錄因子的相互結合從而發揮分子信號功能進而參與基因印記過程；②誘餌作用模式：可理解為lncRNA與具有轉錄調節功能的蛋白質(如轉錄因子、染色體折疊蛋白)相互結合，通過"滴定"的方式調節相關基因的轉錄激活與抑制；③導向作用模式：蛋白與RNA形成核糖核蛋白復合物[9]，lncRNA與核糖核蛋白復合相互結合發揮導向作用模式指導核糖核蛋白復合物定位于特定部位發揮其相應生物學功能，lncRNA募集染色體修飾蛋白通過導向作用瞄定靶基因；④腳手架作用模式：lncRNA可同時結合多個效應分子，為效應分子之間的相互作用提供平臺，之前認為蛋白質在支架復合物中發揮重要功能，近年來發現lncRNA亦發揮相似功能。

2 lncRNA的研究方法

現階段對于lncRNA的研究方法尚未形成成熟且統一的研究體系。但較多lncRNA相關研究應用的方法相似：首先經過全基因組測序找出具有明顯表達差異的基因作為研究目的基因，之后將在組織、血清、細胞中分別驗證目的基因的差異表達與測序結果的一致性，若存在目的基因在胃癌標本與正常標本間的明顯差異表達，則在細胞水平進行細胞表型的相關研究及進一步的機制研究：lncRNA與蛋白質、基因之間的相互作用及在信號通路中發揮的功能研究，最后在動物模型中進行活體實驗驗證。

目前用于lncRNA的主要研究方法：微陣列、轉錄組測序、Northern印跡、實時熒光定量逆轉錄-聚合酶鏈反應，熒光原位雜交、RNA干擾和RNA結合蛋白免疫沉淀等。高通量測序用于轉錄組所開發的轉錄組測序技術可在全基因組范圍內進行基因的差異表達篩選分析，該技術由于其通量高，可重復性高，檢測范圍寬，定量準等特點現已廣泛用于RNA的相關研究中[20]。

盡管轉錄組測序技術可獲取較為豐富的生物信息，但由于對樣本的濃度及純度均有較高要求，因此針對不易提取理想實驗濃度及純度的lncRNA研究者們提出了表達定量的3′端測序(3SEQ)，相較于轉錄組測序，該測序方式對于樣品濃度及純度要求相對較低，3SEQ非特異性更低，這對提高實驗結果的準確性有重要意義。

3 lncRNA在胃癌發生發展中的作用

腫瘤標志物是由癌細胞經代謝改變而產生，且長期存在，可指示癌變過程的腫瘤相關抗原。lncRNA作為腫瘤標志物，對于胃癌的診斷有較高特異度及靈敏度。胃鏡與活組織檢查相結合仍是現階段被惟一公認確診胃癌較為精確的手段與金標準。但作為有創性檢測手段，活組織檢查不易被患者所接受。

lncRNA與消化系統惡性腫瘤間有密切關系,研究發現,多數lncRNA在胃癌患者組織及血清血漿中表達上調。H19在胃癌組織中的表達明顯高于癌旁組織，胃癌患者術后血漿中H19水平明顯下降：H19作為胃癌診斷標志物的靈敏度達74%，特異度達58%[14]；已有研究證明，LINC00152在胃癌組織及血漿中呈穩定過表達，研究者在不同的胃癌細胞株中檢測發現，LINC00152表達明顯高于正常胃細胞，將LINC00152作為腫瘤標志物對胃癌的診斷表現出較高的靈敏度和特異度[14]；胃癌患者術前血漿中FERL4水平與正常對照組無明顯差異，但在術后2周再次檢測基因水平，研究者發現患者術后血漿中FERL4水平明顯下降[15]。

除上述在胃癌中表達升高的lncRNA，某些lncRNA在胃癌組織及血液中檢測水平不一致的情況。LSINCT-5、 PTENP1在腫瘤組織中表達下調，而在血漿中的水平上調，這種在血漿和組織中表達水平不一致的情況可能是由于體內主動分泌所引起的，具體原因需進一步研究論證；CUDR在血漿中水平下調，而在腫瘤組織中的表達尚無相關文獻進行探討；研究者將上述三種lncRNA相結合作為胃癌診斷的生物指標發現，早期胃癌患者的診斷靈敏度77.8%，特異度97%，AUC為0.832[6]。研究表明同時結合多種在胃癌患者體內特異表達的lncRNA可提高胃癌患者診斷的靈敏度及特異度，預示lncRNA有成為腫瘤標志物的巨大潛力。

由于組織活檢的有創性腫瘤患者不易接受，血清、血漿中所提取lncRNA的濃度較低。因此有研究開始聚焦于獲取并檢測胃液中的腫瘤標志物，從而補充由于組織及血液檢測的限制性導致診斷特異度及靈敏度不足。相較于傳統的組織及血液等取材來源，胃液具有以下優勢：胃液僅存在于胃內且易于獲取；胃液中腫瘤標志物含量豐富；相比于血清等，胃液可更加直觀地反映胃癌標志物的表達水平[16]。有關胃液細胞學與分子學的研究已證實胃液分析在胃癌診斷、預后中所發揮的重要作用，研究者將LINC00152、AA174084、UCA1、 H19等多種胃癌相關lncRNA在血清和胃液中的表達進行比較，結果顯示上述幾種lncRNA在胃液中的表達普遍高于血清中。但亦有學者指出胃液中的惡性腫瘤標志物(如CEA、CA19.9)診斷胃癌的特異度與靈敏度對臨床工作的指導有限[17]，因此胃液中腫瘤標志物用于胃癌診斷的價值還需進一步研究論證。

lncRNA還可以外泌體的形式分泌到細胞外，在不同細胞間進行傳輸[18]。外泌體大量存在于人體的體液當中，主要包括血液、唾液、腦脊液和乳汁等。目前研究發現，外泌體的功能主要包括：參與集體抗原呈遞，免疫應答，細胞遷移，細胞分化，腫瘤遷徙等。相關研究表明，腫瘤相關的外泌體可參與到腫瘤細胞與基底細胞相關的遺傳信息交換，從而導致大量新生血管的生成，促進腫瘤的生長與侵襲。據統計，外泌體在胃癌的侵襲、轉移、免疫逃避及耐藥性等生物學行為的相關研究中已取得較多新進展[19,20]。體液中的lncRNA有作為腫瘤標志物的潛力，提示胃癌的進展與惡性程度，為胃癌的個性化治療提供指導。

除上述實驗研究外，有研究者按照一定的納入與排除標準對研究對象進行系統評價發現，lncRNA作為胃癌診斷標志物對胃癌的診斷有一定價值。但目前有關lncRNA作為胃癌診斷的腫瘤標志物研究仍較少，大多研究機制闡述尚不完善，且現有研究結果缺少大規模數據的支持論證，尚需深入研究。

4 lncRNA調控胃癌發生發展的機制

胃癌根據病理類型可分為胃腺癌、胃黏液腺癌、胃印戒細胞癌，三種類型胃癌患者雖然臨床病理特征有所差異，但預后差異并無統計學意義。

lncRNA作為非編碼基因，通過行使信號分子、誘餌分子、支架分子、引導分子等作用模式，發揮對轉錄、轉錄后、表觀遺傳等的調節作用從而對胃癌發生發展過程進行調控。

惡性腫瘤的發生發展與多種因素相關，lncRNA通過與DNA、蛋白質、其他RNA相互作用賦予胃癌細胞惡性表型[10]。lncRNA影響胃癌發生發展過程的機制主要包括以下方面：①某些lncRNA(如LINC00978、CASC15)通過誘導細胞周期停滯和抑制細胞凋亡促進細胞增殖，從而影響胃癌的進展[11]；②通過影響EMT過程抑制或加速細胞遷移和侵入：LINC00978通過活化轉化因子信號通路，進而影響EMT過程進展，促使該基因在胃癌患者組織、血清及胃癌細胞中的表達升高；③作為內源競爭性RNA和miRNA競爭與靶基因結合進而影響下游信號通路，促進胃癌的發生發展，LINC01410通過發揮內源競爭性RNA的功能抑制miR-532-5p表達，使其下游信號通路(NF-κB通路)持續激活，促進胃癌轉移[12]；④通過影響細胞自噬、代謝應激和缺氧促進胃癌的進展[13]。

綜上所述，lncRNA作為大量存在于人體內的非編碼基因，通過發揮對轉錄、轉錄后、表觀遺傳等生物過程的調節作用，調控胃癌的發生發展。大量研究證實在胃癌患者的組織和血液中均可檢測到具有明顯表達差異的lncRNA。存在于人體組織及血液中的lncRNA還可以外泌體的形式分泌到細胞外，并在不同細胞之間進行傳輸；外泌體大量存在于人體體液中，與腫瘤相關的外泌體還可參與到腫瘤細胞及基底細胞相關的遺傳信息交換，促進大量新生血管的生成以及腫瘤的生長與侵襲，因此lncRNA有望作為胃癌診斷的相關腫瘤標志物。