溫度和氨氮濃度對水體N2O釋放的影響

路俊玲,陳慧萍,肖 琳

?

溫度和氨氮濃度對水體N2O釋放的影響

路俊玲,陳慧萍,肖 琳*

(南京大學環境學院,污染控制與資源化國家重點實驗室,江蘇 南京 210023)

氧化亞氮的釋放已經成為了一個全球性的環境問題,水體中N2O的釋放量會隨著氮含量的增加而增加.本文通過微宇宙系統的構建,分析氮的轉化過程和氮轉化基因的變化,并結合結構方程模型分析了溫度、氨氮含量對水體N2O釋放的貢獻.研究結果發現氨氧化古菌和反硝化細菌豐度均與N2O釋放呈正相關,表明水體中的硝化和反硝化作用都會造成N2O的釋放.氨氮濃度的升高并不直接促進N2O的釋放,而溫度和通過硝化作用產生的硝態氮對N2O的釋放有促進作用.此外,硝化速率通過促進亞硝態氮和反硝化菌的豐度而間接地促進N2O的釋放.

氧化亞氮；溫度；硝化；反硝化；結構方程模型

化肥的大量使用和污水的無序排放,造成大量的氮素進入水體,不僅加劇了水體富營養化,也成為N2O的重要釋放源[1-3]. N2O作為重要的溫室氣體[4],其溫室效應是CO2的298倍,并且能造成臭氧層的破壞,引起臭氧層空洞[5-7].已經有研究證實在氮含量高的河道[8]、湖泊等水體都有較高的N2O釋放[9].

在缺氧和厭氧條件下,N2O的產生主要由反硝化過程驅動,而近年來研究發現氨氧化細菌(AOB)和氨氧化古菌(AOA)也能產生N2O[10-11]. AOB和AOA主要通過3種途徑產生N2O:一是通過氨單加氧酶在氧化氨的過程中N2O作為副產物產生[12];二是AOB可以通過羥胺脫氫酶直接將氨氧化過程中產生的羥胺(NH2OH)氧化為N2O[13];此外,AOB含有基因,還能夠在缺氧條件下通過硝化菌的反硝化作用將NO2-還原為NO和N2O[14-15].雖然目前已有大量研究表明在土壤中硝化反應對N2O的釋放發揮重要的作用[16-19],但關于水體中硝化作用對N2O釋放的貢獻還不清楚.

富營養化湖泊中硝化反應速率受到氨氮濃度和溫度的影響,過高的游離氨濃度會抑制亞硝酸氧化細菌活性,導致N2O的積累[20].而溫度對硝化和反硝化作用均有重要影響[21],并且AOA和AOB對溫度的響應各有不同[22].如溫度的升高可以直接促進氨氧化菌的增殖和潛在硝化能力[23],而冬季低溫條件下氨氧化菌因為有較多的氧供給及較少的競爭作用比夏季的豐度更高[24].溫度和氨氮如何通過影響硝化、反硝化過程,從而影響N2O的產生,目前尚不清晰.

本文通過構建微宇宙系統,研究氨氮濃度和溫度對水體中氮的轉化、N2O釋放過程的影響;通過構建結構方程模型,區分硝化、反硝化過程對N2O釋放的貢獻及其對環境因子的響應.這對更全面地認識和指導富營養化水體修復措施的實施,減少溫室氣體N2O的排放具有重要意義.

1 材料與方法

1.1 試驗設計

微宇宙試驗,通過在實驗室模擬不同的生態系統進行研究,既能夠保持生態系統的復雜性,又使結果具有可重復性,在生態學研究中被廣泛應用[25].本次研究于2017年6月在太湖(30°58′14.37′′N, 120°8′16.40′′E)采集水樣,冰袋低溫保存立即運回實驗室.取3L水樣置于5L的加塞廣口玻璃缸中,構建微宇宙系統[26].微宇宙系統設2個氨氮濃度,分別為不添加和添加NH4Cl至氨氮終濃度為30mg/L.分別于5,15及25℃下黑暗靜置培養,防止藻類的生長.在試驗開始的第1,3,5,10,15,20和25d定期采集水樣,用于理化性質和定量PCR分析.每組試驗3個平行.

1.2 水樣理化性質分析

總氮(TN),氨氮(NH4+),硝態氮(NO3-)和亞硝態氮(NO2-)、總有機碳(TOC)測定均采用文獻中的方法[27].

NH4+凈轉化速率(NATR)和NO3-凈轉化速率(NNR)的計算分別采用公式(1)和公式(2)進行:

式中:C為(n+x) d的NH4+或NO3-濃度(mg/L),C為第() d的NH4+或NO3-濃度(mg/L),為天數(d).

1.3 N2O的采集和測定

每次采樣時用注射器采集5mL頂空氣體,轉移到3mL的密閉玻璃瓶中用于分析N2O的產生量.N2O的濃度采用Agliet7890B氣相色譜儀測定,檢測器為電子捕獲器(ECD).檢測條件為:柱溫55℃、后檢測器(ECD)溫度300℃,載氣為高純氮氣,流速為30mL/min,燃氣為氫氣,流速為45mL/min[28].

1.4 DNA的提取和實時熒光定量PCR(qPCR)

DNA的提取和qPCR參照文獻的方法進行[29]. qPCR采用20μL反應體系進行:10μL SYBR?Premix Ex Taq?(Takara), 100nM引物, 1.5μL模板DNA.細菌和古菌的基因分別采用amoA1F/amoA2R, Arch–amoAF/Arch–amoAR引物進行擴增,反應條件為:94℃ 2min;94℃ 20s,57℃ 30s (AOB) 或55℃ 30s (AOA),40個循環.反硝化基因的擴增采用引物cd3af/r3cd,反應條件為:94℃ 2min;94℃ 30s, 57 ℃ 45s,72℃ 45s,40個循環.

1.5 統計分析和結構方程模型分析

水體理化指標和qPCR數據進行One–Way ANOVA分析,平均數的比較采用Fisher’s LSD檢測.生物和環境因子間的關系進行Pearson相關性分析,并通過結構方程模型分析環境因子對氮轉化過程、相關功能微生物和N2O釋放的直接和間接影響[30].以上統計分析均在IBM SPSS 22.0(SPSS Inc.,美國)中進行.

2 結果與分析

2.1 不同氨氮濃度和溫度條件下氮轉化及N2O的釋放

在無外源氮添加的情況下,體系中的氨氮主要來源于有機氮降解,在3個溫度下氨氮濃度都很低.不同溫度下對照組氨氮的凈轉化速率在0.06~ 0.11mg NH4+-N/(L×d)范圍內波動,組間沒有顯著性差異(圖1,2),表明在低氨氮情況下,溫度對氨氮的轉化沒有顯著性影響.

圖1 NH4+-N(a), TN(b), NO3--N(c)在不同氨氮濃度和溫度條件下的變化

圖2 氨氮凈轉化速率(NATR) (a)和硝態氮凈轉化速率(NNR) (b)

在低氨氮情況下,在5℃時,最終有2.72mg/L的硝態氮產生,其凈產生速率與氨氮的轉化速率基本相同(0.1mg NO3--N/(L×d),說明硝化作用在氮的轉化中占據優勢.在15℃和25℃時,分別只有7%和3%的氮氮減少量被轉化為硝態氮,同時硝態氮的凈產生速率也只占氨氮轉化的18%和15%(圖2),表明溫度的升高促進了反硝化作用的進行并使體系中總氮降低.

圖3 不同氨氮濃度和溫度下N2O的產生

在有高氨氮添加時,氨氮濃度在所有處理組中都持續下降,表明即使在低溫下氨氮也能夠被快速轉化(圖1).同時,氨氮的轉化速率在25℃時達到最高,表明高氨氮情況下氨氮的轉化速率與溫度呈正相關.在15℃時,NO3-的產生速率約為氨氮轉化速率的60%,在25d時,超過90%的氨氮被轉化為硝態氮,表明此時硝化作用仍占主要作用.在25℃時,體系中氨氮濃度的減少(28.86mg/L)與總氮的減少(20.30mg/L)和硝態氮的生成量(8.45mg/L)之和呈化學劑量平衡,說明耦合了硝化作用的反硝化過程在氮的轉化過程中占主要作用.

N2O的產生在培養開始時即可以在所有體系中檢測到.N2O 的產生量在未添加氨氮的體系中較低.在添加了高濃度氨氮的體系中,5℃條件下N2O的產生量也顯著低于15和25℃的處理.在15和25℃條件下,從第5d起N2O的產生量即明顯高于對照,其中25℃時N2O的產生速率和產生量顯著高于15℃.

2.2 氨氧化(amoA)和亞硝酸鹽還原酶(nirS)基因豐度的動態變化

如圖4所示,在全部微宇宙體系中,氨氧化菌的和反硝化菌的基因豐度都隨著時間而增加.AOA的基因豐度大約比AOB的基因高一個數量級(圖4),表明AOA是水體中主要的氨氧化菌.相比于對照,在5和25℃時AOA的基因拷貝數隨著氮的添加而降低,在15℃時添加銨鹽促進了AOA的生長.

與氨氧化菌相比,低溫對反硝化菌增殖的抑制作用更為顯著.在5和15℃條件下,25d時,未添加氨氮的對照組中的拷貝數僅較起始拷貝數增加了20%和30%.但在25℃條件下,添加氨氮的處理組中的拷貝數則迅速增加,表明此時反硝化菌具有較高的代謝活性.

圖4 amoA基因(a、b)及nirS(c)基因豐度變化

2.3 溫度、氨氮濃度對氮轉化過程及N2O釋放的影響

通過person相關性分析發現,N2O的釋放與溫度、NO2-和NO3-濃度、PNR以及AOA-、AOB-和(表1)呈顯著正相關.但氨氮和總氮濃度都與N2O的釋放無顯著相關.

表1 生物和環境因子與N2O釋放的相關性分析

圖5 影響N2O產生因子的SEM分析

圖中所標均具有顯著性作用,實線代表正向促進作用,虛線代表抑制作用.線的粗細代表作用強度的大小

進一步通過SEM分析了溫度和氨氮濃度對氮轉化過程、N2O釋放的直接和間接影響,所構建的結構方程模型能夠解釋90%的N2O釋放的影響(2=0.90).SEM結果表明NO3-(=0.767,<0.001)和溫度(=0.136,<0.05)顯著提高N2O的釋放,但NH4+對N2O的釋放沒有直接作用(圖5).NH4+顯著促進(=0.251,<0.05)和NO2-(=0.277,<0.01)的量,而(=0.493,<0.001)和NO2-(=0.433,<0.001)與NO3-呈顯著正相關.此外,AOA對(=0.651,<0.001)和PNR(=0.748,<0.001)有強烈的促進作 用.

3 討論

氮的生物可利用性及溫度是影響氮轉化的兩大重要因素.結構方程模型分析的結果表明,溫度的升高能直接促進N2O的釋放,而高氨氮主要是通過加快硝化速率,縮短硝化反應時間,從而加速N2O的釋放.高氨氮體系中,N2O的釋放在體系中很快開始,并且即使在以硝化作用為主的體系中,N2O依然能夠大量產生,這表明在水體中硝化作用可以是產生N2O的主要途徑.在未添加氨氮的處理組中也檢測到了N2O的釋放,說明有機氮經礦化作用后所產生的NH4+也能通過硝化作用增加N2O的釋放.在25℃和高氨氮情況下,20d以后體系中的氮以硝態氮形式存在,并且氮轉化過程以反硝化作用為主,表明反硝化作用也在N2O的產生中發揮重要作用.溫度影響著氮轉化細菌的生長以及酶的活性,同時也會影響N2O從水體中釋放的傳質阻力,這些因素造成了在低溫(5℃)條件下N2O的產生量較低.在本研究的微宇宙試驗中,反硝化過程并不占優勢.在低溫條件下,的豐度也增長緩慢,表明低溫抑制了反硝化細菌的活性和生長.但與前人報道[24]類似,5℃的低溫并未對AOA和AOB的增長造成顯著性抑制.N2O的釋放與NO2-和NO3-濃度呈現顯著的正相關關系,這也表明在NO2-和NO3-生成的過程中伴隨著N2O的釋放[16].但隨著氨氧化的進行,體系中的DO逐漸被消耗造成缺氧或厭氧環境,這時反硝化作用的發生也將導致大量N2O的釋放.

沉積物中通過反硝化作用產生N2O已經引起了重視[2].相比于沉積物而言,湖泊、河流等水體中上覆水的體量更大,直接接受外源的氮輸入,并且在N2O的釋放過程中受到的傳質阻力更小而更容易釋放.本文的研究結果表明,除了反硝化作用,水體中的硝化作用也會產生N2O,并且隨著溫度和氨氮濃度的升高,N2O的釋放量也隨之增加.溫度的升高可以直接促進N2O的釋放.氨氮濃度的升高雖然并不直接作用于N2O的釋放,但其一方面可以通過促進硝化作用的進行而增加N2O的釋放;同時,硝化作用所產生的NO2-和NO3-又可以通過耦合反硝化過程間接促進N2O的產生.結構方程模型分析結果表明,溫度和氨氮濃度的升高均能促進N2O的釋放,并且進一步區分了硝化、反硝化在N2O釋放過程中的貢獻,這使得我們對溫度及不同形態的氮素對N2O釋放風險的影響有了更全面的認識.因此,富營養化水體治理過程中,不僅要控制以硝酸鹽為主的反硝化過程,更要加強對氨氮等其它各種形式氮素的控制,這對于有效降低N2O的產生,減少溫室氣體的排放具有重要意義.

4 結論

4.1 水體中硝化、反硝化作用的增加均能促進N2O的釋放.

4.2 溫度的升高可以直接促進水體中N2O的釋放,而氨氮濃度的升高主要通過提高硝化反應速率,加速N2O的產生.

[1] Wang H, Yang L, Wang W, et al. Nitrous oxide (N2O) fluxes and their relationships with water-sediment characteristics in a hyper-eutrophic shallow lake, China [J]. Journal of Geophysical Research : Biogeosciences, 2007,112(G1):129-137.

[2] Liu W, Wang Z, Zhang Q, et al. Sediment denitrification and nitrous oxide production in Chinese plateau lakes with varying watershed land uses [J]. Biogeochemistry, 2015,123(3):379-390.

[3] Marzadri A, Dee M M, Tonina D, et al. Role of surface and subsurface processes in scaling N2O emissions along riverine networks [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2017,114(17): 4330-4335.

[4] Wan S, Ward T L, Altosaar I. Strategy and tactics of disarming GHG at the source: N2O reductase crops [J]. Trends in Biotechnology, 2012, 30(8):410-415.

[5] Ravishankara A R, Daniel J S, Portmann R W. Nitrous oxide (N2O): the dominant ozone-depleting substance emitted in the 21st century [J]. Science, 2009,326(5949):123-125.

[6] 郭樹芳,齊玉春,董云社,等.滴灌對農田土壤CO2和N2O產生與排放的影響研究進展 [J]. 中國環境科學, 2014,34(11):2757-2763.Guo S, Qi Y, Dong Y, et al. Response of production and emission of CO2and N2O of agricultural soil to drip irrigation [J]. China Environmental Science, 2014,34(11):2757-2763.

[7] Myhre G, Shindell D, Breon F M, et al. Anthropogenic and natural radiative forcing [J]. Climate Change, 2013,423:658-740.

[8] McMahon P B, Dennehy K F. N2O Emissions from a Nitrogen- Enriched River [J]. Environmental Science & Technology, 1999,33(1): 21-25.

[9] Seitzinger S P, Kroeze C. Global distribution of nitrous oxide production and N inputs in freshwater and coastal marine ecosystems [J]. Global Biogeochemical Cycles, 1998,12(1):93-113.

[10] Wrage N, Lauf J, del Prado A, et al. Distinguishing sources of N2O in European grasslands by stable isotope analysis [J]. Rapid Communications in Mass Spectrometry, 2014,18(11):1201-1207.

[11] Philippot L, Hallin S, Schloter M. Ecology of denitrifying prokaryotes in agricultural soil [J]. Advances in Agronomy, 2007,96:249–305.

[12] Hink L, Lycus P, Gubry-Rangin C, et al. Kinetics of NH3-oxidation, NO-turnover, N2O-production and electron flow during oxygen depletion in model bacterial and archaeal ammonia oxidisers [J]. Environmental Microbiology, 2017,19(12):4882-4896.

[13] White C J, Lehnert N. Is there a pathway for N2O production from hydroxylamine oxidoreductase in ammonia-oxidizing bacteria [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2016,113(51): 14474-14476.

[14] Shaw L J, Nicol G W, Smith Z, et al. Nitrosospira spp. can produce nitrous oxide via a nitrifier denitrification pathway [J]. Environmental Microbiology, 2006,8(2):214–222.

[15] Shi X, Hu H W, Zhubarker X, et al. Nitrifier-induced denitrification is an important source of soil nitrous oxide and can be inhibited by a nitrification inhibitor 3,4-dimethylpyrazole phosphate (DMPP) [J]. Environmental Microbiology, 2017,19(12):4851-4865.

[16] Hink L, Nicol G W, Prosser J I. Archaea produce lower yields of N2O than bacteria during aerobic ammonia oxidation in soil [J]. Environmental Microbiology, 2017,19(12):4829-4837.

[17] Baggs E M. A review of stable isotope techniques for N2O source partitioning in soils: recent progress, remaining challenges and future considerations [J]. Rapid Communications in Mass Spectrometry, 2008,22(11):1664-1672.

[18] Wrage N, Velthof G L, Beusichem M L V, et al. Role of nitrifier denitrification in the production of nitrous oxide [J]. Soil Biology & Biochemistry, 2001,33(12):1723-1732.

[19] Davidson E A. Pulses of nitric oxide and nitrous oxide flux following wetting of dry soil: An assessment of probable sources and importance relative to annual fluxes [J]. Ecological Bulletins, 1992,42(42):149- 155.

[20] Chen G, Cao X, Song C, et al. Adverse Effects of Ammonia on Nitrification Process: the Case of Chinese Shallow Freshwater Lakes [J]. Water, Air & Soil Pollution, 2010,210(1-4):297-306.

[21] Bachand P A M, Horne A J. Denitrification in constructed free-water surface wetlands: II. Effects of vegetation and temperature [J]. Ecological Engineering, 1999,14(1/2):17-32.

[22] Zeng J, Zhao D, Yu Z, et al. Temperature Responses of Ammonia- Oxidizing Prokaryotes in Freshwater Sediment Microcosms [J]. Plos One, 2014,9(6):e100653.

[23] Stark J M. Modeling the temperature response of nitrification [J]. Biogeochemistry, 1996,35(3):433-445.

[24] Christman G D, Cottrell M T, Popp B N, et al. Abundance, Diversity, and Activity of Ammonia-Oxidizing Prokaryotes in the Coastal Arctic Ocean in Summer and Winter [J]. Applied & Environmental Microbiology, 2011,77(6):2026-2034.

[25] 杜秀英,竺乃愷,夏希娟,等.微宇宙理論及其在生態毒理學研究中的應用 [J].生態學報, 2001,21(10):1726-1733.Du X, Zhu N, Xia X, et al. The theory of microcosm and its application in ecotoxicology [J]. Acta Ecologica Sinica, 2001,21(10): 1726-1733.

[26] 黃 偉,朱旭宇,曾江寧,等.氮磷比對東海浮游植物群落生長影響的微宇宙實驗[J]. 環境科學, 2012,33(6):1832-1838.Huang W, Zhu X, Zeng J, et al. Microcosm Experiments on the influence of different N/P ratios on phytoplankton community growth in the East China Sea. Environmental Science, 2012,33(6):1832-1838.

[27] 國家環境保護總局.水和廢水監測分析方法 [M]. 北京:中國環境科學出版社, 2002:236-284.National Environmental Bureau. Methods for the analysis of water and wastewater. Chinese Environmental Science Press, Beijing, 2002:236- 284.

[28] 邢麗貞,鄭德瑞,孔 進,等.高氨氮廢水短程硝化過程中N2O釋放試驗研究[J]. 環境科學學報, 2016,36(4):1260-1265. Xing L, Zheng D, Kong J, et al. N2O emission during short-cut nitrification of high ammonium containing wastewater [J]. Acta Scientiae Circumstantiae, 2016,36(4):1260-1265.

[29] Peng Y, Liu L, Jiang L, et al. The roles of cyanobacterial bloom in nitrogen removal [J]. Science of the Total Environment, 2017,609: 297-303.

[30] Arhonditsis G B, Stow C A, Steinberg L J, et al. Exploring ecological patterns with structural equation modeling and Bayesian analysis[J]. Ecological Modelling, 2006,192(3):385-409.

Coupling effect of temperature and ammonia on N2O emission in surface water.

LU Jun-ling, CHEN Hui-ping, XIAO Lin*

(State Key Laboratory of Pollution Control and Resource Reuse, School of the Environment, Nanjing University, Nanjing 210023, China)., 2019,39(1)：330~335

The increase of nitrous oxide emission has become a worldwide problem. The emission of nitrous oxide from water body increased with the increase of N inputs. Our study analyzed the roles of temperature and ammonia in N2O emission through quantification of nitrogen transformation and related functional genes. The results showed that the abundance of ammonia oxidizing archaea and denitrifiers positively correlated to N2O emission in water. Structural equation model revealed ammonia content had no direct effect on N2O emission, however, high temperature and nitrification directly accelerated the release of N2O. In addition, nitrification process also increased the release of N2O indirectly through promoting abundance of denitrifiers and nitrite content.

nitrous oxide；temperature；nitrification；denitrification；structural equation mode

X524

A

1000-6923(2019)01-0330-06

路俊玲(1994-),女,山東青島人,南京大學碩士研究生,主要研究方向為環境微生物學.發表論文2篇.

2018-06-19

國家水體污染控制與治理科技重大專項(2017ZX07204002)

* 責任作者, 教授, xiaolin@nju.edu.cn