城市不同源霧霾顆粒物健康風險差異評估比較

蔣錦曉,何建波,陳 彬,李 寧,陳菲菲,單曉棟,唐 娟,張杭君,2*

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城市不同源霧霾顆粒物健康風險差異評估比較

蔣錦曉1,何建波1,陳 彬1,李 寧1,陳菲菲1,單曉棟1,唐 娟1,張杭君1,2*

(1.杭州師范大學,生命與環境科學學院,浙江 杭州 310016；2.杭州師范大學,生態系統保護與恢復杭州市重點實驗室,浙江 杭州 310016)

通過研究不同來源霾顆粒物對大鼠氣管上皮細胞(RTE cells)電阻抗變化和細胞自噬因子的影響,評價不同來源霾顆粒物對人體健康風險的差異性.分別將RTE暴露于從居民區(I),高架交通源(II)和化工園區(III)采集的3種霧霾顆粒物中,統一暴露濃度和時間分別為100mg/L和24h.通過電子細胞基質阻抗檢測(ECIS)細胞增長引起的阻抗變化和細胞電損傷恢復時間;通過蛋白免疫印跡測定p62, Atg5, Atg7, Beclin1, LC3B和mTOR蛋白表達量來分析比較不同來源霧霾顆粒物對RTE細胞自噬的影響.結果表明,與空白對照組相比,不同霧霾顆粒物處理組細胞電損傷恢復時間分別延長了34.6%, 63.2%和78.0%; p62蛋白表達量差異顯著性下降, Atg5, Atg7, Beclin1, LC3B蛋白表達量差異顯著性上升.此外, mTOR相關蛋白表達量差異顯著性下降, 分別下降了4.38%, 3.34%和2.36%; p-mTOR蛋白表達量與空白組相比,實驗組I下降24.2%,實驗組II下降37.0%,實驗組III下降60.9%.由以上結果可知,不同來源霧霾顆粒物對RTE細胞均有一定的毒性損傷作用,能夠減小細胞增長速度和削弱細胞修復能力,增強細胞自噬因子蛋白的表達,且化工園區采集的霧霾顆粒物毒性強于居民區和高架交通源.不同來源霧霾顆粒物的細胞毒性存在明顯差異,基于細胞電損傷恢復時間的測定以及自噬相關蛋白的檢測方法能夠為霧霾顆粒物健康風險評價提供一種快速的生物學手段.

霧霾顆粒物；大鼠氣管上皮細胞；電子細胞基質阻抗檢測；自噬；健康風險評價

近年來,霧霾天氣的持續存在受到世界范圍的關注,霧霾顆粒物污染是導致霧霾天氣的主要因素,由于其廣泛的危害而備受各界關注[1-2].霧霾顆粒物除了能破壞免疫系統增加新生兒的患病幾率之外,還能破壞人體的呼吸系統,心血管系統和神經系統等[3-5].有研究報道,霧霾顆粒物極易到達肺泡,引發過敏性鼻炎,哮喘等急性和慢性呼吸系統疾病[6].流行病學研究證明在高濃度霧霾顆粒物的長期暴露下,會使得肺癌,動脈硬化等呼吸疾病的發病率大大增加[7-8].目前,呼吸道上皮細胞是眾多肺部疾病的重點關注對象.評價不同來源霧霾顆粒物在相同濃度下對呼吸道上皮細胞的毒性差異以及發病機理顯得尤為重要.

霧霾顆粒物的基本特征和監測方法研究較為深入,發現其危害取決于它的粒徑大小和化學組分[9].霧霾顆粒物粒徑越小,越容易進入人體產生毒害作用.研究報道,PM1、PM2.5和PM10都能誘導A549細胞引發炎癥反應,PM1因其粒徑小而具有更強的基因毒性[10].另外,不同來源的霧霾顆粒物含有不同的污染組分,對細胞具有不同的毒害作用.研究發現含有化工園區采集的霧霾顆粒物具有大量過渡金屬而誘導A549細胞產生氧化應激[11];交通源采集的霧霾顆粒物中含有大量有機成分而能誘導肺泡II型上皮細胞產生內質網應激而加劇細胞自噬[12].霧霾顆粒物成分復雜,難以對所有組分進行測定,因此缺乏不同來源的霧霾顆粒物組分及毒性的同步研究[9,13].

為了維持細胞內部穩態,細胞自噬扮演了極其重要的角色.自噬一旦啟動,自噬泡逐漸拉長形成雙層膜囊泡(自噬體).泛素化Atg7共軛Atg5是自噬前體結構延伸的關鍵.Atg5和卷曲螺旋蛋白進一步相互共軛,使其形成四聚體[14].Atg7的脂質化將LC3-I轉化為LC3-II,從而使LC3與自噬囊泡結合形成自噬小體[14-15].mTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶,在調節自噬中也起著關鍵作用[16].Beclin1是酵母ATG6的同源物,是哺乳動物參與自噬的特定基因[17].研究表明,Beclin1聯合凋亡抑制因子Bcl-2蛋白可以抑制自噬.Beclin1基因表達的上調可以刺激并引發哺乳動物細胞中的自噬[18].有研究證明,外源化學物能夠誘導細胞自噬,但含有多種外源化學物的霧霾顆粒物毒害機制依舊尚未明確[19].

本研究采用RTE細胞作為研究對象,將其暴露于3個不同地點(居民區,高架交通源,化工園區)采集的霧霾顆粒物中.通過ECIS測定細胞增殖以及細胞損傷恢復時間,蛋白印跡免疫法測定p62,Atg5,Atg7, Beclin1,LC3B和mTOR相關蛋白表達量,來闡明3種不同來源的霧霾顆粒物在相同濃度暴露下引起RTE細胞不同程度自噬損傷產生的分子機理.旨在為評估城市中不同地點空氣中霧霾顆粒物的健康風險提供科學依據.

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

RTE細胞株(大鼠氣管上皮細胞)(北京北納); DEME高糖培養液(美國 Gibco);胰蛋白酶(美國 Gibco);胎牛血清(美國 Gibco);30%丙烯酰胺溶液(美國Bio-Rad);BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天);ECL發光液(美國GE);電子細胞基質阻抗判斷儀(美國Applied Biophysics);EDTA(美國,Sigma); YH-1000型大流量粉塵顆粒物采樣器(青島精誠);玻璃纖維濾膜(美國Waterman)37℃,5%細胞培養箱(美國SHELLAB);生物超凈臺(北京中科BCM- 1600A);恒溫水浴鍋(白典HHS-21-8);PVDF轉印膜(美國Millipore).

1.2 霧霾顆粒物采集與暴露母液配置

圖1 采樣點位示意

霧霾顆粒物的采樣點設置在杭州市區和近郊典型的達標區域,分別為I居民區,II高架交通源和III化工園區,位置如圖1所示.使用青島精誠YH- 1000型大流量粉塵顆粒物采樣器,采樣流量()為30L/min,使用玻璃纖維濾膜(Waterman,美國)收集(濾膜直徑為47mm,孔徑為0.6μm).本次實驗采樣時間段為2017年12月~2018年4月,非雨天多次采樣,所有采樣點在每天的北京時間8:00~18:00同時進行采樣,霧霾顆粒物采集后,將吸附于玻璃纖維濾膜的霧霾顆粒物進行分組收集和混合,分別密封保存于陰涼,干燥的場所,標記為I,II,III,待用.從3組混勻的霧霾顆粒物中選取適量顆粒物,對其進行超聲振蕩洗脫15min,根據文獻報道和預實驗結果,使用生理鹽水分別配制成100mg/L的暴露液(標記為I,II,III),置于-80℃中進行儲存.

1.3 細胞培養與暴露

先前凍存的RTE細胞株在37℃恒溫水浴鍋中快速融化,再在無菌條件下轉移至含有2mL DMEM高糖培養基無菌離心管中,在1000rpm轉速的離心機中離心5min.轉移沉淀至含有5mL完全培養基的細胞培養瓶中,置于恒溫37℃,CO2體積分數5%,培養至細胞存活率達80%~90%.之后,棄取上清液,再加入2mLPBS進行漂洗,加入1mL0.25%酶液對細胞進行消化至細胞呈現圓形.再加入2mL完全培養基完成消化后,以1:2比例進行傳代接種細胞.培養方法參照霍婷婷等[20]研究.

細胞進行暴露時,取出配制好的100mg/L霧霾顆粒物暴露母液恢復至常溫,用微量移液器進行充分混勻,在超聲振蕩儀中振蕩5min X 3次,以0.1倍單位體積的比例加入單位體積的細胞培養液.

1.4 ECIS 檢測細胞增殖和電損傷恢復時間分析

細胞粘附發生在細胞與培養基底之間,當細胞在工作電極上生長繁殖,使得阻抗增大,電流值減小.電阻的變化與細胞數目具有一定的數學關系,可以根據測定的阻抗值得到細胞數目[21].

將培育的RTE細胞使用PBS漂洗之后接種到ECIS八孔電極板培養基上.然后將細胞層置于含有1mmol/L EDTA的PBS中,在37℃下孵育10min,然后用0.05%(/)胰蛋白酶在1.5mmol/L EDTA存在下消化10min.胰蛋白酶消化結束后,加入完全培養基,細胞進行重新分布于培養基中.使用血細胞計數板控制每個培養基細胞密度為4×105,施加1μA, 4kHz的交流電壓,觀察細胞阻抗變化.

培養在ECIS八孔培養基中的RTE細胞匯合率達80%~90%,給予細胞電壓5V,頻率40kHz的電信號,持續30s,電極板上的部分細胞死亡而脫落,造成電極上出現空白區域,引起阻抗的變化.當周圍的細胞重新匯聚到電擊區域,且鋪滿電極時,阻抗又重新恢復至電擊創傷前的水平,相隔時間即為RTE細胞電損傷恢復時間.每組設置3個平行樣.

1.5 細胞自噬相關蛋白表達量檢測

本實驗使用了含有蛋白酶抑制劑的全蛋白提取試劑盒,以及BCA試劑盒測定蛋白質濃度.10%的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)處理3h,每個微凝膠井的總蛋白約為70μg.將甘氨酸溶液恢復30min至室溫,在將SDS-PAGE轉移到使用甲醇處理過的聚偏氟乙烯膜(PVDF),一起放入甘氨酸中在100V電壓下處理5min,再放入寒冷環境中處理2h.在室溫下,將PVDF膜放入T-TBS和5%脫脂牛奶中搖晃1h,之后再用T-TBS清洗3次,每次5min.處理之后,將PVDF膜放置在含有3%脫脂奶粉的T-TBS溶液中并加入蛋白相應的第一抗體(Anti- MOR antibody,Santa Cruz SC-7488;Anti-LC3B antibody, Santa Cruz SC-292354; Anti-Beclin- 1antibody, Santa Cruz SC-10086; Anti-ATG- 5antibody, SC-133158; Anti-ATG-7antibody, Santa Cruz SC-376212; Anti-p-62antibody, Santa Cruz SC-514790),在4℃環境中反應12h后,取出膜清洗之后將其放入含2%脫脂奶粉的T-TBS中,并且以1:5000比例加入第二抗體,反應1h之后,再次使用T-TBS清洗每5min一次,進行5次,結果使用β-Actin基因蛋白表達量作為內參蛋白,重復以上步驟.1mL增強化學發光工作液在轉移孵化前處理PVDF膜1min之后,移除工作液.之后在X射線下觀察5~10min,利用軟件Bandsacn5.0進行數據處理.

2 結果與分析

2.1 RTE細胞電損傷恢復時間的變化

A為RTE細胞電損傷過程示意圖;B為電擊后不同來源霧霾顆粒物暴露下阻抗變化及電損傷恢復時間

由圖2可以看出,與對照組相比,霧霾顆粒物處理組RTE細胞電損傷恢復時間都顯著性增加(<0.01).在4h時加5V,40kHz的電擊,阻抗明顯下降,隨后隨著細胞增長阻抗逐漸增加.實驗組I電損傷恢復時間是空白組的1.35倍,實驗組II是空白組的1.63倍,實驗組III是空白組的1.78倍.也進一步說明在不同來源的霧霾顆粒物暴露下RTE細胞修復能力不同程度地下降.

2.2 p62蛋白表達量的變化

由p62蛋白表達量變化圖(圖3)可知,在霧霾顆粒物暴露下,與對照組相比,處理組的RTE細胞內p62蛋白表達量差異顯著性下降(<0.01).在RTE細胞正常生長情況下,p62蛋白表達量是實驗中I暴露下的1.14倍,是實驗組II的1.59倍,是III化學工業園區的2.19倍.

2.3 LC3B蛋白表達量的變化

在霧霾顆粒物暴露下,與空白處理組相比,RTE細胞內LC3B蛋白表達量差異顯著性上升(<0.01),實驗組I霧霾顆粒物暴露下LC3B蛋白表達量上升了4.8倍,實驗組II LC3B蛋白表達量上升了10.6倍,實驗組II LC3B蛋白表達量上升了13.6倍(圖4)

2.4 Atg5和Atg7蛋白表達量的變化

圖5 不同霧霾顆粒物誘導對RTE細胞Atg5和Atg7蛋白表達量的影響

A: Atg5蛋白表達量; B: Atg7蛋白表達量

從圖5中可以看出,在霧霾顆粒物暴露下,RTE細胞內Atg5和Atg7蛋白表達量都差異顯著性增高(<0.01).與對照組相比,實驗組III的Atg5蛋白表達量增加了762%,相比于實驗組I增加了32%,相比于實驗組II增加了10%;實驗組III Atg7蛋白表達量增加了1059%,相比于實驗組I增加了132%,相比于實驗組II增加了32%.

2.5 Beclin1蛋白表達量的變化

由圖6結果可知,在霧霾顆粒物暴露下,與對照組相比,RTE細胞內Beclin1蛋白表達量差異顯著性升高(<0.01),實驗組I Beclin1蛋白表達量增加了3.69倍,實驗組II增加了6.08倍,實驗組III增加了7.27倍.

2.6 mTOR相關蛋白表達量的變化

圖7為mTOR相關蛋白表達量變化圖.從圖中可以看出,在霧霾顆粒物暴露下,RTE細胞中p-mTOR蛋白表達量顯著下降(<0.01),并且,mTOR蛋白表達量也顯著下降(<0.01).與空白組相比,實驗組I p-mTOR蛋白表達量下降24.2%,實驗組II下降37.0%,實驗組III下降60.9%.對mTOR蛋白表達量而言,與空白組相比,實驗組I下降了4.4%,實驗組II下降了3.3%,實驗組III下降了2.3%.

3 討論

根據文獻[22-23]報道,霧霾顆粒物通常在10~100mg/L的暴露濃度下,會對細胞產生明顯毒效應.通常情況下10mg/L的霧霾顆粒物溶液往往需要多次采樣才能配制,由于不同采樣點霧霾顆粒物吸附的污染物存在一定差異,為了便于統一比較,因此,本文全部使用采自于I居民區,II高架交通源,III化工園區的霧霾顆粒物配制的100mg/L暴露溶液誘導RTE細胞,進行差異性比較.研究結果表明RTE細胞在相同濃度(100mg/L)的霧霾顆粒物暴露24h后,與空白組相比,實驗組的細胞增長速度下降,細胞電受損恢復時間顯著延長,p62,Beclin1,Atg5,Atg7,LC3B蛋白表達量都顯著下降,且mTOR蛋白表達量差異顯著性下降.實驗數據表明相同濃度不同來源的霧霾顆粒物誘導細胞自噬的程度呈現化學工業園區>高架交通源>居民區的趨勢,說明相同濃度不同來源的霧霾顆粒物對細胞自噬的影響具有差異性.LC3B和Beclin1蛋白表達量的顯著變化,說明霧霾顆粒物能夠誘導細胞發生自噬現象,且p62,Atg5,Atg7和mTOR基因都與霧霾顆粒物誘導的自噬扮演重要角色.

霧霾顆粒物因含有不同生物有機成分和無機成分會導致不同的物理化學過程,它的毒效應也會隨著所含組分的不同而具有差異性[24-25].過渡金屬,VOC和PAH以不同比重存在于霧霾顆粒物中,從而使得霧霾顆粒物具有不同的毒效應.Zhang等[26]研究表明PM2.5能夠使得GC-2spd細胞增殖率明顯下降.在5V,40kHz的高壓脈沖下,RTE細胞產生控制性傷害,從電極上脫落,使得阻抗下降,當重新鋪滿電極時阻抗恢復[27].本研究結果顯示,霧霾顆粒物暴露下的RTE細胞電損傷恢復時間明顯延長,說明細胞增長能力即細胞的修復能力下降且呈現實驗組III<實驗組II<實驗組I<空白組的趨勢,電損傷恢復時間實驗組III>實驗組II>實驗組I>空白組,說明相同濃度下不同來源的霧霾顆粒物對RTE細胞具有不同程度的毒性損傷作用.而細胞增長能受多方面調控,自噬過程參與調解了細胞損傷過程,實現細胞自我保護作用[28].

細胞自噬過程是自噬體與體內溶酶體融合形成自噬溶酶體,降解細胞內多余物質從而維持細胞內穩態的過程.目前,在酵母和高等動物中,已經發現有超過30種自噬相關基因和基因產物受自噬過程調控,被稱作“Atg”[29].Atg5被譽為自噬的“核心”,Atg7是一種類似泛素化蛋白E1的蛋白,能夠激活Atg12與Atg5結合形成Atg12-Atg5復合物,Atg7能促進該復合物與Atg16結合使得雙層膜伸長,參與自噬體脂膜擴張過程.有研究報道,Atg5和Atg7基因的抑制表達很大程度地減少了HuH7細胞自噬可能性[30].Kiyono等[30]研究發現PM2.5能夠明顯地提高A549細胞中自噬相關基因Atg5和Beclin1蛋白表達量,證明了Beclin1在PM2.5誘導的細胞自噬中扮演著極其重要的角色.在哺乳動物自噬過程中,LC3-I轉化為LC3-II是形成自噬體關鍵的一步[31],且在此轉化過程中,Atg7起到非常關鍵的作用.LC3B被認為是自噬發生的標志性蛋白,有研究報道,LC3B在香煙煙霧誘導的細胞自噬中起關鍵作用[30].p62是一種泛素結合蛋白,寡聚化后進入內質網自噬體形成位點,與LC3相互作用,使得自噬體脂膜不斷擴張,從而不斷擴大自噬體體積,因此在自噬過程中扮演著極其重要的角色[32-33].Su等[34]將Raw264.7cells暴露于20,50,100mg/L PM2.5懸浮液中,發現p62蛋白表達量明顯下降,LC3蛋白表達量明顯上升,從而促進細胞自噬.本研究結果顯示,RTE細胞在霧霾顆粒物的暴露下,聚泛素化蛋白p62表達量下降,Atg5,Atg7,LC3B和Beclin1蛋白表達量上升,表明Atg5,Atg7,LC3B和Beclin1自噬相關基因參與介導了霧霾顆粒物誘導的RTE細胞毒性損傷過 程.

雷帕霉素靶蛋白質(mTOR)是一種非典型絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,在自噬過程中控制著自噬體的形成和成熟[35].有研究報道,mTOR能通過P13K/ AKT/mTOR路徑誘導細胞自噬[35].Su等[34]將Raw264.7細胞暴露在PM2.5中,發現在此實驗中mTOR蛋白表達量隨著霧霾顆粒物濃度增加而下降更為明顯,從而誘導細胞自噬.在本研究中,mTOR蛋白表達量明顯下降,與空白組mTOR蛋白表達量相比,實驗組I下降4.38%,實驗組II下降了3.34%,實驗組III下降了2.36%;p-mTOR蛋白表達量與空白組相比,實驗組下降了24.2%,實驗組II下降了37.0%,實驗組III下降了60.9%.說明mTOR對霧霾顆粒物誘導的RTE細胞毒性損傷有一定的調控作用,且相同濃度不同來源霧霾顆粒物誘導細胞的自噬具有差異性,呈現化工園區>高架交通源>居民區的強度.

在未來的研究中,將會針對細胞電損傷恢復時間與細胞自噬生物過程與霧霾顆粒物中化學污染物組分和濃度的相關性,進一步深入開展研究.

4 結論

4.1 霧霾顆粒物能夠損壞細胞的修復能力.

4.2 自噬標志蛋白LC3B和Beclin1表達量明顯上升說明霧霾顆粒物能誘導RTE細胞自噬.

4.3 不同來源的霧霾顆粒物對RTE細胞毒效應具有差異性,化工園區>高架交通源>居民區.

4.4 霧霾顆粒物誘導的細胞自噬中, p62, Atg5, Atg7, mTOR起到非常關鍵的作用,上述因子可以作為城市中霧霾顆粒物的健康風險評價重要標志 物.

[1] 王 華,魯紹偉,李少寧,等.可吸入顆粒物和細顆粒物基本特征、監測方法及森林調控功能 [J]. 應用生態學報, 2013,24(3):869-877. Wang Hua, Lu Shaowei, Li Shaoning, et al. Inhalable particulate matter and fine particulate matter: Their basic characteristics, monitoring methods, and forest regulation functions [J]. Chinese Journal of Applied Ecology, 2013,24(3):869-877.

[2] 王 朔,趙衛雄,徐學哲,等.北京一次嚴重霧霾過程氣溶膠光學特性與氣象條件 [J]. 中國環境科學, 2016,36(5):1305-1312. WANG Shuo, ZHAO Weixiong, XU Xuezhe, et al. Analysis of aerosol optical properties and meteorological parameters in a severe haze-fog episode in Beijing [J]. China Environmental Science, 2016, 36(5):1305-1312.

[3] Huang Y C, Ghio A J. Vascular effects of ambient pollutant particles and metals [J]. Current Vascular Pharmacology, 2006,4(3):199-203.

[4] Künzli N, Tager I B. Air pollution: from lung to heart [J]. Swiss Medical Weekly, 2005,135(47/48):697-702.

[5] Sharma R K, Agrawal M. Biological effects of heavy metals: an overview [J]. Journal of Environmental Biology, 2005,26(2):301.

[6] Cohen A J, Ross A H, Ostro B, et al. The global burden of disease due to outdoor air pollution [J]. Journal of Toxicology & Environmental Health, 2005,68(14):1301-1307.

[7] Strasser A, Cory S, Adams J M. Deciphering the rules of programmed cell death to improve therapy of cancer and other diseases [J]. EMBO Journal, 2011,30(18):3667-3683.

[8] Bravo L. Polyphenols: Chemistry, dietary sources, metabolism, and nutritional significance [J]. Nutrition Reviews, 1998,56(11):317-333.

[9] 蔣 燕,熊好琴,魯紹偉,等.2015年北京采暖季城市森林內外SO2濃度的時空變化特征 [J]. 環境科學研究, 2017,30(11):1689-1696.Jiang Yan, Xiong Haoqin, Lu Shaowei, et al. Spatial-temporal variation of SO2concentration in Beijing's Urban forest in heating season, 2015 [J]. Research of Environmental Sciences, 2017,30(11):1689-1696.

[10] Zou Yajuan, Wu Yizhao, Li Yinsheng, et al. Physicochemical properties, in vitro cytotoxic and genotoxic effects of PM1.0, and PM2.5, from Shanghai, China [J]. Environmental Science & Pollution Research, 2017,24(24):19508-19516.

[11] Alfaro-Moreno E, Martínez L, García-Cuellar C, et al. Biologic effects induced in Vitro by PM10from three different zones of Mexico City [J]. Environmental Health Perspectives, 2002,110(7):715-720.

[12] Liu Ying, Chen Yanyan, Cao Jiyu, et al. Oxidative stress, apoptosis, and cell cycle arrest are induced in primary fetal alveolar type II epithelial cells exposed to fine particulate matter from cooking oil fumes [J]. Environmental Science & Pollution Research, 2015,22(13):9728-9741.

[13] 胡 睿,尹 燕,陳 奎,等.南京霧霾天氣中碳質顆粒特征的研究 [J]. 中國環境科學, 2017,37(6):2007-2015. Hu Rui, Yin Yan, Chen kui, et al. Insights into characteristics of carbonaceous particles during haze and fog events in Nanjing [J]. China Environmental Science, 2017,37(6):2007-2015.

[14] Feng Yuchen, Yao Zhiyuan, Daniel J. Klionsky. How to control self- digestion: transcriptional, post-transcriptional, and post-translational regulation of autophagy [J]. Trends in Cell Biology, 2015,25(6):354-363.

[15] Noda N N, Inagaki F. Mechanisms of autophagy [J]. Annual Review of Biophysics, 2015,44(1):101-122.

[16] Sabrina Di Bartolomeo, Marco, Corazzari, Francesca, Nazio, et al. The dynamic interaction of AMBRA1with the dynein motor complex regulates mammalian autophagy [J]. Journal of Cell Biology, 2010, 191(1):155-168.

[17] Mizushima N, Yoshimori T, Levine B. Methods inmammalian autophagy research [J]. Cell, 2010,140(3):313-326.

[18] Kang R, Zeh H J, Lotze M T, et al. The Beclin 1 network regulates autophagy and apoptosis [J]. Cell Death & Differentiation, 2011,18(4): 571-580.

[19] 張建英,張杭君,陳英旭.微囊藻毒素導致鯽魚淋巴細胞凋亡的研究[J]. 環境科學學報, 2005,25(8):1101-1104.Zhang Jianying, Zhang Hangjun, Chen Yingxu. Induction of apoptosis in the lymphocytes of the crucian carp (Garassius auratus) by microcystins [J]. Acta Scientiae Circumstantiae, 2005,25(8):1101-1104.

[20] 霍婷婷,董發勤,鄧建軍,等.幾種高硅質礦物細顆粒的A549細胞毒性對比[J]. 環境科學, 2016,37(11):4410-4418.Huo Tingting, Dong Faqin, Deng Jianjun, et al. Comparation of toxic effect of silicious mineral dusts on lung epithelial A549 Cells [J]. Environmental Science, 2016,37(11):4410-4418.

[21] 蘇凱麒.基于ECIS細胞傳感器和圖像檢測的海洋毒素分析系統設計 [D]. 浙江大學, 2014. Su Kaiqi. Design of marine toxin analysis system based on ECIS and image detection [D]. Hangzhou: Zhejiang University, 2014.

[22] Marco Diociaiuti, Maria Balduzzi, Barbara De Berardis, et al. The two PM2.5(fine) and PM2.5-10(coarse) fractions: evidence of different biological activity [J]. Environmental Research, 2001,86(3):254-262.

[23] Hetland R B, Cassee F R, Refsnes M, et al. Release of inflammatory cytokines, cell toxicity and apoptosis in epithelial lung cells after exposure to ambient air particles of different size fractions [J]. Toxicology. in Vitro, 2004,18(2):203-212.

[24] 呂子峰,郝吉明,段菁春,等.北京市夏季二次有機氣溶膠生成潛勢的估算[J]. 環境科學, 2009,30(4):969-975.Lv Zifeng, Hao Jiming, Duan Jingchun, et al. Estimate of the formation potential of secondary organic aerosol in Beijing summertime [J]. Environmental Science, 2009,30(4):969-975.

[25] Ghio A J, Silbajoris R, Carson J L, et al. Biological effects of oil fly ash [J]. Environmental Health Perspectives, 2002,110(6):88-94.

[26] Zhang Jin, Liu Jianhui, Ren Lihua, et al. PM2.5induces male reproductive toxicity via mitochondrial dysfunction, DNA damage and RIPK1mediated apoptotic signaling pathway [J]. Science of the Total Environment, 2018,634(1):1435-1444.

[27] Yao Cui, Yu An, Jin Tongyu, et al. Real-time monitoring of skin wound healing on nano-grooves atopography using electric cell- substrate impedance sensing (ECIS) [J]. Sensors and Actuators B Chemical, 2017,250:461-468.

[28] Levine B, Kroemer G. Autophagy in the pathogenesis of disease [J]. Cell, 2008,132(1):27-42.

[29] Chen Zhihua, Lam Hilaire C, Jin Yang, et al. Autophagy protein microtubule-associated protein 1light chain-3B (LC3B) activates extrinsic apoptosis during cigarette smoke-induced emphysema [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2010,107(44):18880-18885.

[30] Kiyono K, Suzuki H I, Matsuyama H, et al. Autophagy is activated by TGF-beta and potentiates TGF-beta-mediated growth inhibition in human hepatocellular carcinoma cells [J]. Cancer Research, 2009, 69(23):8844-8852.

[31] Kong H, Xia K, Pan L, et al. Autophagy and lysosomal dysfunction: A new insight into mechanism of synergistic pulmonary toxicity of carbon black-metal ions co-exposure [J]. Carbon, 2017,111:322-333.

[32] Fujita N, Itoh T, Omori H, et al. The Atg16L complex specifies the site of LC3lipidation for membrane biogenesis in autophagy [J]. Molecular biology cell, 2008,19(5):2092–2100.

[33] Nezis I P, Stenmark H. p62 at the interface ofautophagy, oxidative stress signaling, and cancer [J]. Antioxidants & Redox Signaling, 2012: 17(5):786–793.

[34] Su Ruijun, Jin Xiaoting, Zhang Weifeng, et al. Particulate matter exposure induces the autophagy of macrophages via oxidative stress-mediated PI3K/AKT/mTOR pathway [J]. Chemosphere, 2017,167:444-453.

[35] Wang Yu, Nie Hao, Zhao Xin, et al. Bicyclol induces cell cycle arrest and autophagy in HepG2 human hepatocellular carcinoma cells through the PI3K/AKTand Ras/Raf/MEK/ERK pathways [J]. BMC Cancer, 2016,16(1):742.

Comparison and assessment of haze particles health risks from different sources in city.

JIANG Jin-xiao1, HE Jian-bo1, CHEN Bin1, LI Ning1, CHEN Fei-fei1, SHAN Xiao-dong1, TANG Juan1, ZHANG Hang-jun1,2*

(1.College of Life and Environmental Sciences, Hangzhou Normal University, Hangzhou 310016, China；2.Key Laboratory of Hangzhou City for Ecosystem Protection and Restoration, Hangzhou Normal University, Hangzhou 310016, China)., 2019,39(1)：379~385

To evaluate the health risks induced by haze particles sampled from three different areas. The present study assessed the effects of haze particles on electrical impedance and autophagy factors of the tracheal epithelial cells. Rat tracheal epithelial (RTE) cells were exposed to haze particles collected from three different areas, including residential area (I), traffic area (II), and chemical industry park (III) in the megacity Hangzhou, China. The particle concentration was treated and designed as 100mg/L and then a period of 24h exposure was given to cells in treatment groups. The electronic impedance and the time needed for the recovery of electricity damage were determined by ECIS (Electric Cell-substrate Impedance Sensing). Western blot was used to analyze the protein expressions of p62, Atg5, Atg7, Beclin1, LC3B and mTOR to compare the effects of different haze particles on RTE cells autophagy. The results showed that the recovery time of cell injury was prolonged by 34.6%, 63.2% and 78.0%, respectively, when compared with the control group. The expression of Atg5, Atg7, Beclin1and LC3B proteins increased, whereas that of p62protein significantly decreased. The expression of mTOR related proteins decreased significantly by 4.38%, 3.34% and 2.36%, respectively. Compared with the control group, the expression of p-mTOR decreased by 24.2% in group I, 37.0% in group II and 60.9% in group III. All the results suggested that haze particles collected from different functional areas could induce various toxic damages on RTE cells such as reduction of growth speed, impairment of revovery ability, and increased authophagy protein expression. The haze particles from chemical industrial areas showed more toxic effects than those from residential areas and traffic areas. The cytotoxicity of haze particles from different sources is obviously different The determination of cell electrical injury recovery time and the detection of autophagy-related proteins can provide a rapid biological method for health risk assessment of haze particles.

haze particles；rat tracheal epithelial cells；electric cell-substrate impedance sensing；autophagy；health risk assessment

X503.1,X513

A

1000-6923(2019)01-0379-07

蔣錦曉(1997-),女,浙江金華人,杭州師范大學本科生,環境工程專業.

2018-06-11

杭州市科技發展計劃項目(20150533B02);杭州師范大學本科生創新能力提升工程項目(CX2017106)

* 責任作者, 教授, 20080099@hznu.edu.cn