術(shù)中快速檢測(cè)甲狀旁腺激素的膠體金免疫層析試紙的研制

陳 超，唐振林，楊佳良

(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院 a.血管甲狀腺外科，b.核醫(yī)學(xué)科，四川 成都 610072)

近年來，我國(guó)甲狀腺結(jié)節(jié)尤其是甲狀腺癌的發(fā)病率快速上升，需要行甲狀腺全切除術(shù)和(或)頸淋巴清掃術(shù)的患者不斷增加。部分患者因甲狀腺手術(shù)中誤切、損傷甲狀旁腺或因?yàn)槠溲└淖儗?dǎo)致了繼發(fā)性甲狀旁腺功能減退，一直是甲狀腺術(shù)后的嚴(yán)重的并發(fā)癥，發(fā)生率為0.5%～32%[1，2]。臨床表現(xiàn)輕者出現(xiàn)手腳發(fā)麻、抽搐，重者甚至可危及生命，給患者帶來身體和心理上的極大痛苦，同時(shí)也給術(shù)者帶來巨大的工作和心理壓力。因此，術(shù)中如何準(zhǔn)確辨認(rèn)、識(shí)別并且有效保護(hù)甲狀旁腺來降低術(shù)后甲狀旁腺功能減退的發(fā)生，一直是世界各國(guó)研究甲狀腺疾病的重要課題。膠體金免疫層析(GICA)技術(shù)是一種將膠體金標(biāo)記技術(shù)、免疫檢測(cè)技術(shù)和層析分析技術(shù)等多種方法結(jié)合在一起的固相標(biāo)記免疫檢測(cè)技術(shù)，具有簡(jiǎn)便、省時(shí)便捷、采樣隨意、用量少、結(jié)果易判讀等特點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于抗原、抗體的檢測(cè)，以及各種蛋白質(zhì)、激素及藥物等的檢測(cè)。我院2016年1月至2017年12月利用GICA技術(shù)，研制金標(biāo)免疫層析試劑條，通過術(shù)中檢測(cè)組織液中的PTH，從而快速判斷甲狀旁腺，操作快捷、簡(jiǎn)單、實(shí)用。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑材料主要儀器：Techcomp離心機(jī)，劃膜儀、噴金儀、切條機(jī)，均來自上海金標(biāo)生物公司。主要試劑：甲狀旁腺激素標(biāo)準(zhǔn)品，BSA-PTH(甲狀旁腺激素偶聯(lián)BSA)購(gòu)自上海強(qiáng)耀生物科技有限公司；羊抗鼠IgG(15.4 mg/ml)、抗PTH單克隆抗體(15.4 mg/ml)均來自ABCOM公司。材料：硝酸纖維素膜(型號(hào)：CNl40)來自賽多利斯(sartorius Stedim)公司；玻璃纖維棉購(gòu)自上海良信生物科技有限公司；吸水紙由上海金標(biāo)生物科技有限公司提供。

1.2 制備方法

1.2.1膠體金溶液的制備 采用檸檬酸三鈉還原氯金酸法制備膠體金，氯金酸溶液與檸檬酸鈉溶液的體積比為100∶150 μl。

1.2.2膠體金標(biāo)記 采用棋盤法進(jìn)行篩選。用 25 mmol/L K2CO3溶液調(diào)節(jié)膠體金溶液pH值分別為7、8、9、10，分別于不同pH值膠體金溶液中加入PTH抗體溶液，震蕩混勻20 min，靜置30 min，分別加入10 μl的10% NaCl溶液，混勻，靜置30 min，觀察標(biāo)記后膠體金溶液顏色的變化，記錄其顏色變化差異及變?yōu)榧t色的保持時(shí)間，以顏色變化明顯的膠體金溶液與抗體溶液的比例為膠體金標(biāo)記的最佳標(biāo)記比例，以最佳標(biāo)記比例下紅色保持時(shí)間最長(zhǎng)的pH值為膠體金標(biāo)記的最佳標(biāo)記pH值。

1.2.3膠體金-PTH單克隆抗體結(jié)合物的制備 取膠體金，在磁力快速攪拌下加入稀釋的抗PTH單克隆抗體，攪拌后，加入牛血清白蛋白(BSA)，再攪拌后離心棄沉淀，上清液再以離心，吸去上清液，沉淀即為膠體金-PTH單克隆抗體結(jié)合物，4 ℃保存，備用。

1.2.4金標(biāo)結(jié)合墊的制備 選擇玻璃纖維膜作為金標(biāo)結(jié)合墊，將玻璃纖維膜浸泡于0.1 mmol/L pH 8.8 Tris-HCl 緩沖液中5 min，取出，37 ℃烘干。將烘干后的結(jié)合墊浸泡于PTE膠體金標(biāo)記物溶液中，至溶液全部吸收，取出，37 ℃干燥，備用。

1.2.5劃膜 硝酸纖維素膜為試紙的檢測(cè)區(qū)，如圖1設(shè)有質(zhì)控線(C線)，和檢測(cè)線(T線)，C線包被15.4 mg/ml羊抗鼠 Ig G和羊抗兔Ig G，T 線分別包被濃度為0.5 mg/ml、1.0 mg/ml、1.66 mg/ml的半抗原 (BSA-PTH)，劃膜儀調(diào)節(jié)劃膜量為1 μl/cm，劃膜后置干燥間室溫干燥過夜。見表1。

表1 劃膜3張不同濃度T線的試紙條對(duì)比

1.2.6試紙條的組裝 將干燥好的硝酸纖維素膜預(yù)粘貼于PVC膠板上，確定檢測(cè)線和質(zhì)控線的位置，在硝酸纖維素膜上方(C線側(cè))粘貼吸水紙，吸水紙壓住膜約1 mm；在硝酸維素膜下方粘貼金墊，金標(biāo)墊壓住膜約1 mm；在金標(biāo)墊下方粘貼樣品墊，樣品墊壓住金標(biāo)墊約2 mm。試紙組裝工藝如圖1所示。組裝完成后按3 mm寬度切為成品小條，裝入檢測(cè)卡盒中即制成膠體金免疫層析試紙條。

圖1 試紙條組裝示意圖

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1加樣 將甲狀旁腺激素標(biāo)準(zhǔn)品稀釋不同濃度，檢測(cè)試紙條水平放置，取100 μl待測(cè)樣品滴于加樣孔，第10～15 min時(shí)判定結(jié)果，15 min后的結(jié)果無效。

1.3.2結(jié)果判讀 將待檢PTH標(biāo)準(zhǔn)品液滴在試紙條上，如果樣品中的PTH低于檢測(cè)限濃度，則不能競(jìng)爭(zhēng)抑制金標(biāo)抗體與包被在硝酸纖維素膜上的BSA-PTH進(jìn)行第一次免疫反應(yīng)，金顆粒在硝酸纖維素膜表面沉淀析出形成一條紅色條帶(T線)，然后其他未結(jié)合的金標(biāo)抗體繼續(xù)通過毛細(xì)作用向前泳動(dòng)，同樣也形成一條紅色條帶(C線)，這樣形成兩條紅色條帶表示樣品檢測(cè)結(jié)果為陰性；反之，當(dāng)樣品中含有的PTH高于檢測(cè)限濃度時(shí)，溶解后的金標(biāo)抗體大部分與樣品中的PTH進(jìn)行第一次免疫反應(yīng)，僅形成一條紅色條帶(C線)，表明樣品檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性。無論樣品中有無PTH，測(cè)試結(jié)果C線位置都應(yīng)出現(xiàn)紅色條帶，如果無紅色條帶出現(xiàn)則表明測(cè)試無效。見圖2。

圖2 PTH膠體金試紙結(jié)果判定示意圖

2 結(jié)果

2.1 膠體金溶液質(zhì)量鑒定膠體金溶液外觀純凈、透亮，無沉淀及漂浮物。采用紫外分光光度計(jì)掃描，膠體金溶液最大吸收峰波長(zhǎng)為 520 nm，在可見光范圍內(nèi)由單一吸收峰，說明膠體金顆粒比較均勻，大小在20 nm左右。

2.2 膠體金標(biāo)記條件的確定當(dāng)pH為8.0，PTH抗體標(biāo)記量為0.4 mg/ml，膠體金溶液與PTH抗體標(biāo)記比例為3∶1時(shí)，金標(biāo)溶液穩(wěn)定，保持紅色不變。由此確定膠體金標(biāo)記抗體的最適pH為8.0。

2.3 樣品檢測(cè)結(jié)果從表2可看出，檢測(cè)線即包被的BSA-PTH濃度在1.66 mg/ml，PTH標(biāo)準(zhǔn)品濃度在1u/ml是，試紙條呈弱陽(yáng)性，PTH標(biāo)準(zhǔn)品濃度大于10 μg/ml時(shí)結(jié)果呈陽(yáng)性，見圖3。PTH的最低檢測(cè)濃度為1 μg/ml，最適T線濃度為1.66 mg/ml。而術(shù)中組織液中PTH濃度大于500 pg/ml。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：本試紙可以對(duì)甲狀旁腺激素準(zhǔn)作出定性判定，符合預(yù)期目標(biāo)。

表2 不同樣品濃度檢測(cè)結(jié)果

圖3 檢測(cè)陽(yáng)性結(jié)果

3 討論

對(duì)于甲狀腺惡性腫瘤，最有效的治療方法是外科手術(shù)，但術(shù)中因損傷、誤切或影響血供而導(dǎo)致的甲狀旁腺功能減退是甲狀腺術(shù)后最常見的并發(fā)癥[3]。由于甲狀旁腺體積小，其周圍有甲狀腺、脂肪、淋巴結(jié)、肌肉等組織，在術(shù)中只能憑經(jīng)驗(yàn)鑒別，有一定的意外切除率[4]。術(shù)中如何顯露和識(shí)別甲狀旁腺，一直是手術(shù)的重點(diǎn)和難點(diǎn)，目前國(guó)內(nèi)外尚無一種確切有效的方法，手術(shù)醫(yī)生主要靠主觀經(jīng)驗(yàn)識(shí)別甲狀旁腺，術(shù)中精細(xì)化解剖保護(hù)甲狀旁腺。如遇甲狀腺癌需行中央組淋巴結(jié)清掃，特別是雙側(cè)淋巴清掃，對(duì)甲狀旁腺的損傷幾乎不可避免，尤其是下位甲狀旁腺，基本處于淋巴結(jié)清掃范圍內(nèi)。目前病理仍是鑒別甲狀旁腺的金標(biāo)準(zhǔn)，但這需要切除部分甲狀旁腺組織，術(shù)中等待時(shí)間長(zhǎng)、費(fèi)用高。細(xì)針穿刺組織洗脫液的PTH檢測(cè)，用于術(shù)前和術(shù)中鑒別甲狀旁腺的方法，已有文獻(xiàn)報(bào)道[5，6]。

人體內(nèi)只有甲狀旁腺分泌PTH，因而甲狀旁腺組織中PTH水平遠(yuǎn)高于血清PTH水平，而周圍組織、血液的PTH水平均與血清中PTH水平相當(dāng)，在血清PTH正常值范圍內(nèi)。Perrier等報(bào)道[7]，甲狀旁腺腺瘤切除術(shù)65例患者行術(shù)中細(xì)針穿刺抽吸組織液測(cè)定PTH，44份細(xì)針抽吸腺瘤組織測(cè)定PTH值均高于血清中PTH的所能測(cè)定的上限值；剩余組織經(jīng)病理證實(shí)不是甲狀旁腺組織。2004年Kiblut等報(bào)道了在170例患者中進(jìn)行的前瞻性試驗(yàn)，術(shù)中對(duì)甲狀腺、正常甲狀旁腺、增生甲狀旁腺組織采用細(xì)針穿刺抽吸組織測(cè)定PTH并進(jìn)行了對(duì)比，得出了相同的結(jié)論[8]。可見，甲狀腺術(shù)中通過測(cè)定組織液的PTH來判定甲狀旁腺是可行的。

目前PTH的檢測(cè)一般是通過電化學(xué)發(fā)光的方法進(jìn)行的，需大型的檢測(cè)設(shè)備，加上運(yùn)送標(biāo)本，檢測(cè)時(shí)間至少需60 min以上，推廣應(yīng)用在臨床上有難度。以膠體金為標(biāo)記物的GICA技術(shù)是以硝酸纖維素膜為固相載體，通過毛細(xì)作用使樣品溶液在層析條上泳動(dòng)，并同時(shí)使樣品中的待測(cè)物與層析材料上針對(duì)待測(cè)物的受體(抗原或抗體)發(fā)生高特異性、高親和性的免疫反應(yīng)，層析過程中免疫復(fù)合物被富集或截留在層析材料的一定區(qū)域(檢測(cè)帶)，運(yùn)用可目測(cè)的標(biāo)記物(膠體金)而得到直觀的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象(顯色)。目前應(yīng)用最廣泛和最成功的是妊娠試驗(yàn)，早早孕試紙條通過檢測(cè)尿液中人絨毛膜促性腺激素(HCG)以輔助診斷早期妊娠的檢驗(yàn)方法，已在家庭和個(gè)人中廣泛應(yīng)用。通過本研究表明，通過膠體金免疫層析的方法來檢測(cè)甲狀旁腺激素是可行性的，為外科醫(yī)生提供了一種快速、準(zhǔn)確，且在術(shù)中就能實(shí)現(xiàn)甲狀旁腺定性的鑒別方法，以便于術(shù)中更好地保護(hù)甲狀旁腺，降低患者術(shù)后甲狀旁腺功能減退的發(fā)生率。