Nrf2基因多態性與糖尿病視網膜病變的相關性研究

李 曼，任勇剛，張 淼

0引言

糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病患者最常見的并發癥之一，也是成年人致盲最主要的病因之一[1]。研究結果顯示嚴格控制血糖、血壓、血脂等危險因素能有效延緩和減輕糖尿病患者DR等并發癥的發生和發展，但不能徹底阻止其發生，同時還存在部分患者代謝控制不良卻不發生DR，提示DR可能是由環境和遺傳多因素交互作用所致[2]。近年來相繼有研究發現維甲酸X受體基因、醛糖還原酶基因、血管緊張素轉化酶基因和糖基化終末產物受體基因等與DR發生密切相關。越來越多研究證據表明氧化應激可能與DR發病及進展均密切相關[3-4]，氧化應激可導致細胞膜完整性破壞，通過刺激細胞凋亡，加速微血管損害和血-眼屏障破壞，進而參與DR的發生、發展過程。核因子E2相關因子2(NF-E2-related factor 2, Nrf2)是細胞氧化應激損傷的重要保護性因子，近年來不斷有研究發現Nrf2-抗氧化反應元件(antioxidant response element，ARE)通路可能參與DR發病過程[5-6]。Xu等[7]研究發現Nrf2基因多個單核苷酸多態性位點與糖尿病發病無明顯關聯性，但與并發癥發生密切相關。徐曉紅[8]也發現Nrf2基因多態性可能與糖尿病血脂異常及并發癥相關。然而，兩項研究均未就Nrf2基因多態性與DR易感性的相關性進行觀察。本研究以我國陜西漢族人群為研究對象，觀察Nrf2基因多態性與DR的相關性，為臨床工作提供參考。

表1各組基本臨床特征比較

組別例數男性(例,%)年齡(x±s,歲)病程(x±s,a)BMI (x±s,kg/m2)吸煙(例,%)高血壓(例,%)使用胰島素(例,%)對照組12067(55.8)62.5±10.2-24.3±2.936(30.0)28(23.3)-DWR組18192(50.8)63.8±8.914.5±5.823.9±2.754(29.8)40(22.1)98(54.1)PDR組6238(61.3)61.5±11.115.3±5.224.1±3.321(33.9)14(22.6)35(56.5)NPDR組14387(60.8)61.8±8.514.8±4.824.5±3.150(35.0)30(21.0)80(55.9)F/χ24.0281.6110.5451.1941.2840.2180.153P0.2580.1860.5820.3120.7330.9750.926組別空腹血糖 (x±s,mmol/L)糖化血紅蛋白(x±s,%)TG(x±s,mmol/L)TC(x±s,mmol/L)LDL-C (x±s,mmol/L)HDL-C (x±s,mmol/L)對照組5.3±1.55.5±2.01.9±1.55.3±2.73.2±1.41.2±0.3DWR組8.3±2.6a7.1±2.2a2.3±1.65.5±2.43.4±1.61.2±0.3PDR組8.8±3.2a7.8±2.6a2.2±2.25.8±3.03.5±1.81.1±0.4NPDR組9.2±2.7a,c7.3±2.3a2.2±1.85.2±2.33.6±1.51.1±0.4 F60.11020.8641.1380.9841.1082.175P<0.01<0.010.3360.4020.3470.090

注：對照組：健康志愿者；aP<0.05vs對照組；cP<0.05vsDWR組。

1對象和方法

1.1對象選擇2016-01/2017-01于我科門診和(或)住院治療的2型糖尿病(diabetes mellitus type 2，T2DM)患者，T2DM診斷均符合2013年中華醫學會糖尿病學分會制定的2型糖尿病診斷標準[9]，且排除胰島細胞抗體，或胰島素抗體，或谷氨酰胺脫羧酶抗體陽性，以及胰島素釋放試驗胰島素水平低下的患者。參照2014年我國糖尿病視網膜病變臨床診療指南[10]將T2DM組患者分為無視網膜病變(diabetic without retinopathy，DWR)組，增殖期DR(proliferative diabetic retinopathy，PDR)組和非增殖期DR(non-proliferative diabetic retinopathy，NPDR)組，其中DWR組共181例患者，包括男92例，女89例，平均年齡63.8±8.9歲；PDR組共62例患者，包括男38例，女24例，平均年齡61.5±11.1歲；NPDR組共143例患者，包括男87例，女56例，平均年齡61.8±8.5歲。選取同期在我院健康體檢的120例無糖尿病及視網膜疾病的志愿者作為對照組，其中男67例，女53例，平均年齡62.5±10.2歲。所有入組人員均為漢族，彼此無血緣關系。本研究通過本院倫理委員會審核批準，所有入組成員均充分知情同意。

1.2方法臨床資料收集包括年齡、性別、體質量指數(body mass index，BMI)、吸煙史、血壓及糖尿病病史等基本信息，也包括眼科檢查及實驗室檢查結果，眼科檢查包括驗光、小孔視力及裂隙燈顯微鏡檢查，實驗室檢查包括血糖、糖化血紅蛋白、總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)及高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)等。

基因多態性檢測:采集清晨空腹時外周靜脈血用于實驗室檢查，部分樣本采用DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司，北京)提取全血基因組DNA。采用聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)聯合DNA直接測序法檢測Nrf2基因啟動子rs6721961位點單核苷酸多態性。PCR反應體系(25μL)包括： 10×Buffer 2.5μL，上、下游引物各1μL(上游：5’-GGGTTCCCGTTTTTCTCCCAGCTCTGGGTG-3’；下游：5’-TGTTTGCGAAGGTCGCTGGAGTTCGGACGC-3’)，dNTP混合物2μL，TaqDNA聚合酶0.25μL，模板DNA 1μL，不足部分由滅菌蒸餾水補足。反應條件為95℃預變性4min，然后按照變性95℃ 20s、退火65℃ 30s、延長72℃ 50s的順序循環30周期，最后72℃延長3min。取0.5μL延伸產物，經1%瓊脂糖凝膠電泳確定，對PCR產物直接測序。

2結果

2.1各組間基本臨床資料比較四組的性別和年齡差異均無統計學意義，另外在病程，BMI，吸煙，高血壓，使用胰島素情況，TG，TC，LDL-C和HDL-C等指標四組間差異均無統計學意義。DWR組，PDR組和NPDR組分別與對照組比較，空腹血糖及糖化血紅蛋白水平差異均具有統計學意義(P<0.05)，見表1。

圖1rs6721961基因型判讀。

表2各組Nrf2基因型和等位基因分布

分組例數C/CC/AA/ACA對照組12063(52.5)44(36.7)13(10.8)170(70.8)70(29.2)DWR組18198(54.1)65(35.9)18(9.9)261(72.1)101(27.9)PDR組6224(38.7)24(38.7)14(22.6)72(58.1)52(41.9)NPDR組14360(42.0)55(38.5)28(19.6)175(61.2)111(38.8)分組C/COR(95% CI)PC/AOR(95% CI)PA/AOR(95% CI)PCOR(95% CI)PAOR(95% CI)P對照組vs DWR組1.0-0.950(0.578～1.560)0.8390.890(0.480～1.943)0.7701.0-0.940(0.655～1.348)0.736對照組vs PDR組1.0-1.432(0.722～2.839)0.3032.827(1.162～6.879)0.0191.0-1.754(1.116～2.757)0.014對照組vs NPDR組1.0-1.313(0.772～2.232)0.3152.262(1.072～4.772)0.0301.0-1.540(1.068～2.221)0.020DWR組vs PDR組1.0-1.508(0.790～2.879)0.2123.176(1.386～7.275)0.0051.0-1.866(1.221～2.853)0.004DWR組vs NPDR組1.0-1.382(0.854～2.238)0.1882.541(1.295～4.983)0.0061.0-1.639(1.178～2.281)0.003PDR組vs NPDR組1.0-0.917(0.467～1.798)0.8000.800(0.360～1.776)0.5831.0-0.878(0.572～1.348)0.553

注：對照組：健康志愿者。

表3Logistic多因素回歸分析

變量BS.EWaldOR95%CIP性別1.1521.1401.0213.1640.339～29.5550.217年齡0.7110.6851.0772.0360.532～7.7960.179空腹血糖1.1360.4626.0493.1151.260～7.7030.004糖化血紅蛋白1.0370.4635.0172.8221.138～6.9930.007A等位基因0.4270.1389.5551.5321.169～2.0080.014

2.2Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗結果Nrf2基因rs6721961位點基因型包括C/C，C/A和A/A三種，本研究各組rs6721961位點基因型分布經檢驗均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡(P>0.05)，具有群體代表性，見圖1。

2.3各組rs6721961位點基因型和等位基因分布頻率及其與DR的關系DWR組與對照組比較，位點基因型和等位基因分布頻率差異均無統計學意義(P>0.05)；PDR組和NPDR組分別與對照組和DWR組比較，突變純合子(AA基因型)和突變基因(A等位基因)分布頻率差異均有統計學意義(P<0.05)。PDR組和NPDR組比較，基因型和等位基因分布頻率差異均無統計學意義(P>0.05)，見表2。

2.4Logistic多因素回歸分析將PDR組和NPDR組合并，對照組與DWR組合并，采用Logistic多因素回歸分析，校正性別、年齡、空腹血糖及糖化血紅蛋白等混雜因素，rs6721961位點A等位基因與DR相關(OR=1.532, 95%CI： 1.169～2.008,P=0.014)，見表3。

3討論

高血糖狀態下，蛋白激酶C途徑、多元醇途徑及氨基己糖途徑等多條途徑可被激活，使細胞氧自由基產生增多，同時還原性谷胱甘肽等抗氧化劑被大量消耗，機體氧化/抗氧化平衡被打亂，處于氧化應激狀態[3-5]。視網膜作為一種高耗氧組織，較其他組織更容易受到氧化應激損傷。Xu等[5]研究發現高糖條件下，視網膜Müller細胞和血管內皮細胞生成超氧化物明顯增多，細胞凋亡增加，加入抗氧化劑后，細胞凋亡可被抑制。還有臨床研究結果顯示DR患者血清中脂質過氧化物水平明顯高于DWR患者，而DWR患者與正常對照組比較，血清脂質過氧化物水平差異無統計學意義[11]。這些研究證據均提示氧化應激在DR發生及進展過程中發揮重要作用。

Nrf2是體內介導抗氧化應激反應最主要的細胞防御機制之一，氧化應激刺激可激活胞漿中的Nrf2分子，促使Nrf2立即轉位至細胞核內，與ARE結合，調節下游基因表達，包括多種與機體抗氧化相關基因，發揮穩定抗氧化作用[12]。近年來，不斷有研究發現Nrf2與DR密切相關，Nrf2表達減少可能是DR發病的重要原因之一，激活Nrf2表達可能是未來治療DR的重要途徑[6]。有研究發現Nrf2基因敲除的小鼠視網膜色素上皮細胞存在退行性病理改變[13]，還有研究以Nrf2基因敲除小鼠構建視網膜缺血-再灌注損傷模型，發現Nrf2對視網膜缺血-再灌注損傷具有保護作用[14]。此外，血色素氧化酶-1作為Nrf2-ARE途徑下游重要表達產物，也被發現與DR病變過程中視網膜神經元損傷相關。

然而，目前關于Nrf2基因多態性與DR易感性的相關研究鮮有報道，Xu等[7-8]學者研究發現Nrf2基因多個位點與糖尿病患者并發癥發生密切相關，但均未單獨就DR與Nrf2基因多態性進行分析。本研究選擇的Nrf2基因rs6721961 C→A多態性位點位于啟動子上游，可通過調控轉錄的方式來影響Nrf2表達和活性，已被證實與動脈粥樣硬化、癲癇、帕金森等多種病理改變或疾病易感性相關[15-16]。同時該位點在中國漢族人群中存在廣泛變異，適合作為基因多態性研究的位點。本研究結果顯示對照組rs6721961位點A等位基因頻率為29.2%，與既往國人研究結果相符[15-16]。Logistic多因素回歸分析結果顯示rs6721961位點A等位基因均是T2DM患者發生DR的危險因素，表明Nrf2基因rs6721961多態性與DR易感性密切相關，對于進一步證實Nrf2-ARE通路在DR發病過程中的作用，同時提示對于存在rs6721961位點A等位基因，尤其A/A基因型的T2DM患者，更加需要注意DR的預防，加強血糖管理。本研究還發現PDR組和NPDR組rs6721961位點基因型和等位基因分布頻率差異均無統計學意義，提示rs6721961多態性可能與DR進展過程無關，但遺憾本研究未對納入研究對象血清Nrf2水平進行測量，無法評估Nrf2本身與DR進展是否關聯，需要后續研究進一步證實。

綜上所述，Nrf2基因rs6721961多態性可能與DR易感性密切相關，但本研究納入對象有限，需要更多相關研究結果驗證。而且，Nrf2基因包括多個SNP位點，對于其他位點多態性與DR易感性的關系，以及多個位點之間的相互關系尚不明確，也需要后續進一步研究。