蛋白質糖基化接枝改性研究進展

馮燕英 牟代臣 祁文磊 陳茂龍 許 宙 程云輝

(長沙理工大學化學與食品工程學院, 湖南 長沙 410000)

食品蛋白質不僅是最重要的營養成分，還可在不同的加工條件下改變食品的外觀、滋味和質構。然而，食品蛋白質的工業應用往往受限于極端加工條件下的不穩定性，如加熱、剪切等處理；而難以同時具備多種功能特性，也是導致不少天然蛋白質無法滿足更多食品加工要求的主要原因[1]。因此，通過合適的改性技術來拓展天然蛋白質在食品工業中的應用具有重要意義[2]。

蛋白質的改性是通過修飾其結構，改變其理化性質，進而達到改善其功能性質的目的。蛋白質改性常用的方法有物理改性[3-4]、化學改性[1,5]和酶法改性[6]等。大多數化學改性方法因使用了對人體健康有害的試劑而無法應用于食品行業[7]；物理改性的效果主要取決于機械力，且改性效果大多不明顯；而酶法改性主要受限于酶的成本以及蛋白質水解所產生的苦味。深度開發綠色、高效、安全的改性方法一直是蛋白質研究領域的熱點。

蛋白質的糖基化改性是基于美拉德反應機理的羰氨縮合反應，該過程不需任何化學催化劑參與，通過自發的美拉德反應即可使蛋白質分子的ε-氨基與糖分子的還原性末端羰基進行共價結合而實現[1]，所得到的蛋白質—糖共價復合物常可作為性質優良的多功能添加劑，因其反應條件溫和、安全性高而倍受矚目。但因難以控制美拉德反應進程，限制了其工業化、規模化應用；同時，蛋白質糖基化分子修飾的反應機制和糖基化產物構效關系的研究尚未明了。

本文擬綜述近年來國內外蛋白質糖基化接枝改性機理及其反應進程中標志物篩選的研究進展，并對接枝方法進行分析比較，介紹美拉德反應改善蛋白質功能性質的研究現狀，以期為蛋白質糖基化改性提供理論參考。

1 蛋白質糖基化改性的反應機制與進程

1.1 蛋白質糖基化改性的反應機制

糖基化改性由蛋白質、肽或氨基酸側鏈上的游離氨基與還原糖分子末端的羰基縮合引發，形成席夫堿并重排為Amadori或Heyns產物[8]。美拉德反應一般分為3個階段[1]，在初始階段，蛋白質氨基與還原性羰氨發生縮合反應，形成N-糖胺并釋放一分子水形成Schiff 堿，進一步環化為N-取代糖基胺，再經 Amadori 重排生成Amadori產物，即1-氨基-1-脫氧-酮糖。賴氨酸殘基的ε-氨基反應活性最高，此外來自氨基酸的末端胺基團、組氨酸殘基的咪唑基、色氨酸殘基的吲哚基以及精氨酸殘基的胍基也發生不同程度的反應。在中間階段，始于Amadori產物或Heyns產物的降解，可以通過氧化、斷裂、烯醇化、脫水、酸水解和自由基反應而改變，生成多種化合物。其中，Amadori產物的降解取決于體系環境，如pH、時間和溫度等。在酸性條件下，初始階段形成的氨基酮糖或氨基醛糖經1,2-烯醇化生成各種羰基化合物，如羰甲基呋喃醛、麥芽酚、異麥芽酚和還原酮等化合物；在堿性條件下，Amadori產物的降解主要涉及2,3-烯醇化，形成還原酮類，如4-羥基-5-甲基-2,3-二氫呋喃-3-酮以及各種裂變產物，包括縮醛、丙酮醛和丁二酮。這些化合物具有高反應活性，可進一步經strecker降解反應生成醛類、吡嗪及褐色色素[9]。在高級階段，多羰基不飽和衍生物繼續進行裂解反應，形成揮發性化合物；同時還進行醇醛縮合、聚合反應，形成棕色共聚物，統稱為類黑素[10]。

1.2 蛋白質糖基化反應進程

糖基化反應對食品的色澤、風味具有重要意義，但也可能帶來負作用，如乳制品的褐變。同時，糖基化反應高級階段形成的晚期糖基化終末產物(AGEs)，可能在諸如糖尿病、動脈粥樣硬化、阿爾茨海默病等慢性疾病的發病機理中起著重要作用[9]。將糖基化反應進程各階段形成的特征化合物作為標志物來監測與控制反應進程的意義不言而喻。

通常可將294，420 nm處的吸光度值分別作為監測蛋白質—糖美拉德反應中間體的產生(如還原酮、醛類)[11-13]及褐變程度的指標[14-16]。Yu等[13]在研究酸性氨基酸-L抗壞血酸反應進程時，發現在120～150 ℃反應10～120 min的條件下，延長反應時間、升高反應溫度皆會導致294 nm處吸光度值隨之增加，通過擬合420 nm處吸光度值，發現150 ℃時反應速率常數比120 ℃高出10倍。Sheng等[17]采用A294 nm作為考察指標優化了溶菌酶—普魯蘭多糖的改性條件，研究結果表明在糖質比8：1、pH 7.5、60 ℃條件下反應5 d，接枝產物溶解度可由61.73% 提高至 81.61%。

α-二羰基化合物(丙酮醛、乙二醛)、5-羥甲基糠醛(HMF)和還原酮都是美拉德反應的活性中間體[10]，可作為美拉德反應的標志物[18]。Han等[18]研究了棕色發酵乳的加工和儲藏過程，結果表明脫脂奶粉與葡萄糖在95 ℃ 反應180 min時，3-脫氧葡糖醛酮濃度高達(82.13±0.64) mg/L，高出丙酮醛20倍，HMF濃度在60～180 min加工時間內也從(0.16±0.03) mg/L提高至(0.53±0.02) mg/L。此外，在乳制品[1]、肉制品[19]加工領域，也常將糠氨酸作為美拉德反應的標志物。

AGEs也是美拉德反應進程的重要標志物，如羧甲基賴氨酸(CML)和羧乙基賴氨酸(CEL)[10]。Oh等[20]研究發現在酪蛋白和葡萄糖、半乳糖美拉德反應過程中，CML含量隨加熱溫度提高和時間延長而增大，在加熱時間為114.8/117.9 min、溫度為145.1/148.8 ℃時，CML生成量達最大值，分別為12.0/14.0 μg/mL。Courel等[21]研究發現曲奇中AGEs的形成與加熱時間存在相關性，但與加熱溫度呈非線性相關，因而可通過工藝條件優化來減少AGEs的生成。

美拉德反應的中間與高級階段十分復雜，反應機理目前尚不明了，這些階段產生的部分化合物的結構與性質仍有待確定，利用美拉德反應特征化合物監測跟蹤反應進程還需要更深入地開展研究。

2 蛋白質糖基化改性方法

糖基化改性方法主要有干熱法和濕熱法。干熱法反應時需控制體系水分活度在較低狀態，以使蛋白質的氨基處于非聚集或少聚集的狀態，但反應時間往往長達幾天至幾周。濕熱法的反應速度雖有所提高，但在傳統水溶液體系中，蛋白質—糖接枝反應效率一直受到反應溫度和反應物濃度的制約，但反應溫度和反應物濃度的提高又將導致蛋白質更易發生變性或形成更多聚集[22]。

2.1 干熱法

干熱法是一種基于固相體系的反應方法，首先由日本Kato教授[23]提出，將蛋白質和糖均勻分散于緩沖溶液中，然后進行冷凍干燥，通常在50～60 ℃和一定的相對濕度范圍內進行美拉德反應，降溫即可終止反應的進行。

目前已報道的通過糖基化干熱法改性的蛋白質有乳清蛋白[24-25]、酪蛋白[26]、大豆分離蛋白[27]、β-伴大豆球蛋白[28]、小麥蛋白[29]、米渣蛋白[30]等。雖然該法所制備的接枝產物功能特性較好，但反應耗時長，且反應條件較為嚴格，這使干熱法的產業化應用受到了很大限制。

2.2 濕熱法

濕熱法一般是將蛋白質與糖的混合溶液在高溫加熱的條件下進行，主要步驟與干熱法相同，先將蛋白質和糖分散于緩沖溶液中，再置于水浴或油浴中加熱，最后利用冰浴終止反應。

Meng等[31]分別采用干熱、濕熱法制備酪蛋白—葡聚糖接枝物，發現濕熱法制備的接枝物粒徑大小是干熱產物的1.32倍，且對姜黃素具有較好的包埋能力。Yue等[32]研究了大米蛋白水解產物與糖類(單糖、寡糖、多糖)的濕法接枝改性，發現接枝產物的功能性質得到大大改善，溶解性、乳化性及乳化穩定性分別提高了3.5，5.3，7.3倍。

2.3 其他改性方法

傳統濕熱法改性蛋白質因反應時間較長、能耗較高也難以實現工業化應用。近年來，國內外對接枝方法的改進大多聚焦于其他輔助手段與濕熱法的結合，如利用超聲波[33-34]、微波[35-36]、高壓[37]等作為輔助手段。

Wang等[38]利用超聲波輔助濕熱法進行了綠豆分離蛋白和葡萄糖的接枝改性，發現在300 W超聲輔助加熱20 min條件下，接枝產物的接枝度、溶解度、乳化活性均取得最大值。Farzaneh等[35]采用微波輔助濕熱與傳統濕熱法對牛血清白蛋白和麥芽糊精進行糖基化改性，發現微波輔助制備接枝產物的接枝度由傳統濕熱法的29%提高至33%，溶解度從0.745 mg/mL提高至1.105 mg/mL。

目前大量研究報道集中在采用干熱法、濕熱法以及其他技術手段輔助傳統濕熱法改性蛋白質的工藝條件探索上，鮮少有加熱類型對接枝物理化性質影響的報道，不同改性方法反應機制之間差異性的揭示也很少涉及。

3 糖基化改性對蛋白質功能特性的影響

糖基化改性賦予了接枝產物不同于未改性蛋白質的功能性質，已報道的功能特性改善包括溶解性、乳化性、起泡性、凝膠性、熱穩定性和抗氧化、抗菌等活性。

3.1 溶解性

通過糖基化接枝反應改善蛋白質的溶解性是基于糖分子的引入可以增加親水基團的數量，并增強蛋白質的空間穩定性[25,39]。同時，親水性多糖無規則線團結構對蛋白質的屏蔽效應也能減弱蛋白質聚集的趨勢[40]。

Lei等[41]研究發現糖基化制備的燕麥分離蛋白—β葡聚糖共價復合物在等電點附近的溶解度可由5.5%提高至38.6%。Cheng等[42]優化了大米谷蛋白與葡聚糖濕熱反應條件，發現在質糖比5∶1、95 ℃條件下反應20 min 可使接枝度達到52.02%，其溶解性和乳化活性都有明顯改善。Kasran等[43]研究發現大豆乳清蛋白與香豆膠混合物在60 ℃、75%相對濕度環境下反應3 d所獲得的糖基化產物具有良好的溶解性。但Alvarez等[44]研究發現豬血血漿蛋白、血紅蛋白與10 kDa葡聚糖在80 ℃下加熱60 min所獲得的接枝產物，其熱穩定性和乳化性均得到改善，溶解度反而有所降低，這可能歸因于蛋白質以及與之反應的多糖的復雜性[45]。

3.2 乳化性

蛋白質可有效吸附在分散的油—水界面上，從而使其在乳化體系的形成中發揮乳化劑的作用。糖基化改善蛋白質乳化性質主要取決于以下2種作用：接枝物的蛋白質部分吸附在油—水界面上，導致表面張力顯著降低；接枝物的多糖分子鏈吸附在膜的周圍，形成立體網絡結構，增加了膜厚度和機械強度，而多糖的增稠和膠凝行為賦予了膠體穩定性[46]，且分枝多糖提供的更大空間位阻可防止液滴聚集[47]。

Li等[48]研究了糖鏈長度對大豆蛋白水解產物(Mw>30 kDa)功能特性的影響，采用葡萄糖(180 Da)、麥芽糖(342 Da)、麥芽糊精(DE20)和葡聚糖(40 kDa)與大豆蛋白水解產物進行濕法改性，發現接枝產物的乳化性、乳化穩定性均隨糖鏈長度的增長而提高。Safoura等[49]研究發現油菜分離蛋白與阿拉伯樹膠在90 ℃、pH 7.0 條件下獲得的接枝產物，其乳化活性和乳化穩定性分別為61.72 m2/g、70.04 min，顯著高于兩者混合物和油菜分離蛋白。

3.3 起泡性

泡沫一般定義為氣泡在連續液相或者含可溶性表面活性劑狀態下逐漸形成的分散體系。蛋白質起泡性是指蛋白質在攪拌時并入大量空氣在氣—水界面形成薄膜的能力，因蛋白質具有疏水和親水特性，使其能夠作為泡沫分散體系中的穩定劑。

Cheng等[42]研究發現大米蛋白質—葡聚糖接枝物的起泡性及起泡穩定性較改性前分別提高了1.69,2.01倍。Jian等[50]采用干熱法制備的牛血清蛋白—葡萄糖接枝產物的起泡性從80%增加到160%，而發泡穩定性從105%顯著降低到47.5%。

3.4 凝膠性

蛋白質凝膠是通過共價鍵或非共價鍵連接的分子或顆粒所形成的連續三維網狀結構。該網狀結構可容納大量溶劑和其他小分子，從而保留大量液體連續相，以此提高蛋白質的持水性。糖基化改性可改變蛋白質的凝膠特性，通過控制糖的濃度、分子量等因素，調節凝膠網絡結構，從而改變蛋白質的凝膠質構[51]。

Spotti等[7]采用干熱法研究了牛奶乳清蛋白與葡聚糖(6，40,70 kDa)在60 ℃、63%相對濕度環境中加熱不同時間(2，5,9 d)的改性效果，結果表明反應時間顯著影響乳清蛋白的凝膠特性；與乳清蛋白/葡聚糖混合物凝膠相比，發現復合物凝膠在形變量達到80%時仍不會發生斷裂。Sun等[14]也報道了類似的研究結果。

3.5 抗氧化活性

不少學者將糖基化產物表現出的抗氧化活性，歸因于中間階段化合物[24,52](還原酮)以及晚期糖基化產物[53](類黑素)的形成。

Diego等[24]研究了乳清蛋白和葡萄糖、乳糖接枝產物的抗氧化活性，且比較了各階段反應產物的抗氧化性能，結果表明乳清蛋白—乳糖接枝產物具有更強的清除自由基能力。同時還發現抗氧化活性對熱處理時間有很強的相關性，在反應速度較慢體系中，延長反應時間有助于形成更多具有抗氧化活性的產物。Marija等[12]利用12%聚乙二醇(MW6000)制造大分子擁擠環境，研究了超聲輔助乳清蛋白—阿拉伯糖濕法改性效果，發現超聲處理能增加糖基化產物抑制脂質過氧化能力，且在大分子擁擠環境下效果更明顯。Farzaneh等[35]研究發現牛血清白蛋白—麥芽糊精接枝產物具有良好的抗氧化活性，且清除自由基的能力隨糖基化反應程度的加劇而提高。

3.6 抗菌活性

糖基化改性形成的類黑素具有抗菌活性，可能與它們所帶陰離子電荷數以及螯合病原菌生長所必需的陽離子(如Cu2+、Fe2+、Zn2+)的能力相關[9,54]。

I.Habinshuti等[55]發現葵花蛋白與D-木糖在120 ℃水浴中加熱2 h所獲得的糖基化產物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有顯著的抑菌效果，最低抑菌濃度分別為86，70 mg/mL。Hashemi等[56]研究了pH 8.5、60 ℃、10 d 條件下溶菌酶與黃原膠的共價結合效果，與天然溶菌酶相比，當濃度為400 μg/mL時，接枝物表現出更廣泛的抗菌活性。Sheng等[17]研究表明溶菌酶和普魯蘭多糖在60 ℃、pH 7.5條件下反應5 d即可形成具有良好抗菌活性的共價復合物。

現階段通過糖基化改善蛋白質功能特性的研究大多停留在糖基化產物功能特性表征的層面上，蛋白質糖基化分子修飾的反應機制和糖基化產物構效關系的研究還有待繼續深入。

4 展望

蛋白質糖基化改性因反應條件溫和、安全性高，且接枝物表現出多種功能特性而受到青睞，但現階段仍然存在蛋白質—糖接枝物難以實現可控制備以及工業化、規模化應用的局限性。未來研究方向可考慮從以下幾方面展開：① 通過美拉德反應進程臨界條件的控制實現蛋白質—糖接枝物定向可控制備；② 繼續深入探索蛋白質糖基化分子修飾的反應機制和糖基化產物的構效關系；③ 微波、超聲波、脈沖電場等物理輔助手段促進蛋白質糖基化反應機理的研究；④ 糖基化產物的在醫學、材料等其它領域的應用拓展。