干酪中生物活性肽的研究進(jìn)展

陳森怡 劉振民 焦晶凱

(1. 光明乳業(yè)股份有限公司研究院乳業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200436；2. 上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306)

干酪俗稱奶酪，又稱芝士、起司。它是一種以新鮮牛乳為原料，經(jīng)過(guò)巴氏殺菌，添加凝乳酶、發(fā)酵劑，發(fā)酵凝乳切割，成熟等工序制成的新鮮或成熟乳制品[1]。干酪含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、氨基酸、維生素、礦物質(zhì)等成分，是一類營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高的發(fā)酵乳制品[2]。

干酪中乳蛋白經(jīng)過(guò)分解會(huì)產(chǎn)生一系列具有活性的水解產(chǎn)物——生物活性肽。生物活性肽是指對(duì)人機(jī)體具有積極影響并最終影響其健康的特定蛋白質(zhì)片段[3]，其實(shí)這些多肽在親本蛋白質(zhì)分子的序列中并無(wú)活性，但是可以通過(guò)腸胃消化、發(fā)酵劑發(fā)酵或者來(lái)自微生物或植物的蛋白酶水解釋放出有活性的肽組分[4-6]。它主要是含有2～22個(gè)氨基酸殘基的片段，而且不同類型的干酪表現(xiàn)出的生物活性也不同，如免疫調(diào)節(jié)、抗高血壓、抗菌、抗氧化和阿片類藥物活性等，這些都與成熟過(guò)程蛋白質(zhì)的水解作用息息相關(guān)。多肽不僅可以在成熟階段獲得，而且在人體食用干酪時(shí)，胃腸道中的一些蛋白酶會(huì)繼續(xù)水解產(chǎn)生新的肽組分，并對(duì)機(jī)體發(fā)揮一定作用，如對(duì)腸道微生物平衡的改善[7]。

1 干酪多肽的產(chǎn)生

干酪的蛋白質(zhì)含量約25%～35%，且以酪蛋白為主，約占總蛋白含量80%[8]，其中酪蛋白包括α-酪蛋白(αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白)、β-酪蛋白、k-酪蛋白；在干酪的制作過(guò)程中，酪蛋白的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值沒(méi)有發(fā)生改變，但在干酪發(fā)酵和成熟過(guò)程中發(fā)生了蛋白質(zhì)消化/水解作用，消化率近100%。通過(guò)蛋白質(zhì)的水解產(chǎn)生了很多分子量大小不一的多肽以及游離的氨基酸，這些水解產(chǎn)物對(duì)干酪消化性的改善、降低過(guò)敏性以及特色風(fēng)味的形成有很大的貢獻(xiàn)[9-11]。

在干酪成熟階段，蛋白質(zhì)的水解過(guò)程大致分為兩步：① 一級(jí)蛋白質(zhì)水解，αs-酪蛋白、β-酪蛋白在凝乳酶以及牛乳中原蛋白酶(纖溶酶和組織蛋白酶)的作用下初步水解產(chǎn)生許多大(水不溶性)和中等大小(水溶性)的肽[12]；② 來(lái)自發(fā)酵劑和非發(fā)酵劑的蛋白酶降解中等肽，細(xì)胞外、細(xì)胞包膜相關(guān)蛋白酶有助于水解較大的肽，形成小肽；而肽酶(細(xì)胞內(nèi))在細(xì)胞裂解后釋放，并負(fù)責(zé)短肽的降解和游離氨基酸的產(chǎn)生[13]。像Prato(普拉托)干酪蛋白初始水解的主要特征是殘留的凝乳酶作用于αs1-酪蛋白的Phe23-Phe24鍵的，β-酪蛋白在成熟過(guò)程中較慢降解[14]。不同類型的酪蛋白有不同的水解模式，不同的蛋白酶作用于不同的水解位點(diǎn)，由此釋放出功能各異的生物活性肽[15-17]。

2 干酪多肽的生物活性

2.1 ACE抑制肽

高血壓是心腦血管疾病(CVD)最重要的危險(xiǎn)因素[18]，它已經(jīng)成為威脅人們生命健康的“無(wú)形的殺手”，因此高血壓的治療已是迫在眉睫。

人體血壓的調(diào)節(jié)依賴于腎素—血管緊張素和激肽—激肽釋放酶系統(tǒng)，血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensin converting enzyme，ACE) 是兩體系中的關(guān)鍵性酶，它是一種與膜結(jié)合的二肽羧肽酶，其含維持活性的Zn2+與Cl-[19-20]。ACE可催化血管緊張素I(無(wú)活性的十肽)向血管緊張素II(血管收縮因子)的轉(zhuǎn)化，而使血管收縮；另外ACE可使舒緩激肽(血管舒張因子)轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)活性的緩激肽，兩體系協(xié)同作用導(dǎo)致人體血壓的升高[21]。若能抑制ACE的活性，即可達(dá)到降血壓的效果。目前臨床合成降壓藥物有卡托普利、賴諾普利等，但這些藥物副作用大，因此當(dāng)今世界衛(wèi)生保健部門(mén)面臨的主要挑戰(zhàn)之一是從天然資源中獲取ACE抑制劑。而干酪已被廣泛地用于研究ACE抑制肽。

1985年，Maruyama 等[22]從酪蛋白胰蛋白酶水解物中分離出具有ACE抑制活性的十二肽(CEI12)，以及起源于β-酪蛋白七肽和五肽，它們?cè)谑蟮淖訉m和回腸的收縮中增強(qiáng)了緩激肽的作用，且其增強(qiáng)效果持續(xù)超過(guò)90 min。采用不同的分離鑒定方法獲得氨基酸序列結(jié)構(gòu)各不相同，但同樣具有降壓效果的抑制肽。Bütikofer等[23-24]借助HPLC-MS3技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)硬質(zhì)、半硬質(zhì)、軟質(zhì)奶酪中均含具有ACE抑制活性的三肽VPP和IPP，但是平均濃度存在一定的差異，且提出牛奶預(yù)處理、熱燙條件和成熟時(shí)間可能是影響這2種天然多肽濃度的關(guān)鍵因素。Stephanie等[25]的研究驗(yàn)證了成熟期對(duì)肽濃度的影響，成熟期越長(zhǎng)顯示了更高的ACE抑制活性，另外還指出不同分子量的肽組分IC50值存在差異，相較分子量>10，>5 kDa 的組分，<5 kDa的肽組分具有更強(qiáng)的ACE抑制活性。Hernández等[26]通過(guò)凱氏定氮法(Kjeldahl method)，每周取樣以確定酸可溶性氮(ASN)、非蛋白氮(NPN)和乙醇可溶性氮(EtOH-SN)指數(shù)，結(jié)合分光光度法和HPLC，發(fā)現(xiàn)墨西哥Cotija硬質(zhì)干酪在成熟結(jié)束后達(dá)到了100% ACE抑制作用，ACE抑制肽活性與每種氮級(jí)分中存在的肽的類型高度相關(guān)。眾多αs1-酪蛋白衍生肽以及β-酪蛋白衍生肽(如AYFYPEL、LHLPLP)在不同的干酪(如帕瑪森、布里、高達(dá)、哥瑞納干酪)中被鑒定出[27-28]。目前眾多ACE抑制肽的結(jié)構(gòu)序列陸續(xù)被鑒定，但是仍需要進(jìn)行體內(nèi)研究以驗(yàn)證抗高血壓作用。

2.2 抗氧化肽

人體內(nèi)自由基的產(chǎn)生和清除處在動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，當(dāng)體內(nèi)自由基過(guò)量時(shí)，就會(huì)發(fā)生氧化反應(yīng)導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生多種疾病。研究[29]表明，通過(guò)膳食供應(yīng)是降低機(jī)體氧化應(yīng)激水平的一種現(xiàn)實(shí)可行的方法。食源性抗氧化肽由于天然安全、抗氧化性高的特點(diǎn)備受人們的關(guān)注，是目前研究較熱的多肽。而干酪由于其富含優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)也成為人們研究抗氧化肽的一個(gè)極好的出發(fā)點(diǎn)。

María等[30]制作干酪時(shí)分別添加植物、動(dòng)物、微生物凝乳酶，發(fā)現(xiàn)添加植物凝乳酶的干酪有更高的抗氧化活性，而且這些抗氧化肽段的N末端中存在更多的疏水性氨基酸(如Val或Leu)，這也可能是造成更高抗氧化性的原因之一。有學(xué)者[31-33]在研究抗氧化肽的構(gòu)效關(guān)系中也得出了疏水性的氨基酸是抗氧化肽的特征結(jié)構(gòu)，對(duì)自由基清除活性的貢獻(xiàn)更大。對(duì)抗氧化肽活性的評(píng)估常用DPPH、ABTS自由基清除法。Stephanie等[25]對(duì)切達(dá)奶酪水溶液進(jìn)行分級(jí)處理得到不同分子量肽組分，發(fā)現(xiàn)分子量>10 kDa的肽組分有更高的DPPH自由基的清除力，其清除率達(dá)到13%左右。有研究[34]評(píng)估菲達(dá)干酪、佩科里諾干酪和洛克福干酪，ABTS自由基清除率為32%～45%，但只有洛克福干酪顯示了DPPH自由基清除活性，而且其抗氧化肽與先前已鑒定的肽有共享序列。Mushtaq等[35]發(fā)現(xiàn)冷藏和室溫條件下對(duì)Himalayan奶酪的抗氧化性有顯著性提高，而冷凍條件下無(wú)任何的影響，這也間接證明Himalayan奶酪具有潛在的營(yíng)養(yǎng)功能性，但是其生物利用度有待進(jìn)一步的研究。

2.3 抗菌肽

抗菌肽是微生物發(fā)酵、酶消化或體外蛋白水解的產(chǎn)物。它們來(lái)源安全、無(wú)公害，較少會(huì)引起細(xì)菌的耐藥性，因此廣受國(guó)內(nèi)外研究者的青睞，更加能被消費(fèi)者所接受。Lima等[36]研究了來(lái)自巴西伯南布哥州的Coalho干酪的粗提物，發(fā)現(xiàn)其對(duì)糞腸球菌ATCC 6057、枯草芽孢桿菌ATCC 6633、大腸桿菌ATCC 25922和銅綠假單胞菌ATCC 27853有抗菌效果；并指明大約5 g的干酪便能夠抑制這些病原微生物生長(zhǎng)。另研究[37]發(fā)現(xiàn)Coalho干酪中，免疫調(diào)節(jié)和抗菌肽多為αs1-酪蛋白衍生肽(f1-23)，這被確定為巴西奶酪權(quán)威性的標(biāo)志。Fialho等[38]借助MALDI-TOF / TOF、MASCOT Daemon與UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)合對(duì)肽進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)2種新的β-酪蛋白衍生的抗菌肽序列HQPHQPLPPT和MHQPHQPLPPT，但其生物活性未知。Théolier等[39]評(píng)估了5種干酪(馬蘇里拉、高達(dá)、瑞士、中期、長(zhǎng)期成熟切達(dá)干酪)的水溶性提取物(WSE)對(duì)幾種食源性病原體的抗菌性，在脫鹽和有機(jī)酸之前，不同干酪對(duì)李斯特菌ivanovii、單增李斯特氏菌、大腸桿菌MC4100和大腸桿菌O157：H7有不同程度抗菌效果。但經(jīng)脫鹽純化后，只有馬蘇里拉和高達(dá)干酪對(duì)李斯特菌ivanovii和大腸桿菌MC4100有明顯的抗菌效果，說(shuō)明WSE的純化處理對(duì)干酪抗菌性有一定影響。另有研究[40-42]發(fā)現(xiàn)肽的疏水性對(duì)抗菌活性也有一定的貢獻(xiàn)，而且處理?xiàng)l件(溫度、pH、離子濃度)對(duì)抗菌肽活性有顯著影響。目前，關(guān)于干酪水溶性提取物的抗菌肽研究頗多，但有關(guān)直接食用干酪在體內(nèi)顯示抗菌效果的研究并不多。

3 干酪活性肽的生物利用與轉(zhuǎn)化

生物活性肽需經(jīng)過(guò)胃腸道的消化吸收后才能在機(jī)體內(nèi)有效發(fā)揮作用，但胃腸道中的一些蛋白酶的存在是限制其吸收的重要阻礙。生物利用度是指攝取的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)或活性物質(zhì)能夠用于發(fā)揮生理功能或者能夠在體內(nèi)儲(chǔ)藏，它是評(píng)價(jià)營(yíng)養(yǎng)有效性的一個(gè)關(guān)鍵指標(biāo)。現(xiàn)在很多關(guān)于多肽提取分離、氨基酸序列鑒定及構(gòu)效關(guān)系的研究[40][43]89-90，但是人體攝入的多肽如何在胃腸道中保持穩(wěn)定性，并被人體吸收以發(fā)揮其功能性，是當(dāng)前研究的重要課題。

Regazzo等[44]研究了牛乳β-酪蛋白具有免疫功能的f(193～209)十七肽，通過(guò)Caco-2細(xì)胞模型的單層轉(zhuǎn)運(yùn)發(fā)現(xiàn)，僅有1%的肽組分能夠被吸收。有些多肽是能夠經(jīng)胃腸道到達(dá)血液發(fā)揮作用。有學(xué)者[27，45]對(duì)不同類型的干酪進(jìn)行了體外胃腸道消化試驗(yàn)，通過(guò)消化前后肽譜的對(duì)比發(fā)現(xiàn)ACE抑制肽的類型和總量發(fā)生很大變化，且IC50值降低，說(shuō)明其抗高血壓活性提高。而且通過(guò)Caco-2細(xì)胞模型試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)部分ACE抑制肽可被部分吸收。對(duì)生物活性肽的研究不僅僅限制于體外模擬試驗(yàn)，體內(nèi)研究更加重要，但是有關(guān)體內(nèi)研究數(shù)據(jù)相對(duì)較少。Caira等[46]進(jìn)行人體試驗(yàn)，受試者每天攝入100 g奶酪(1 g酪蛋白磷脂肽，CPPs)1周，并在血漿中檢測(cè)到酪蛋白磷脂肽CPPs。用含酪蛋白配方食物喂食小鼠2周和4周后，在血漿中檢測(cè)到β-酪啡肽(BCM)。

Giacomo等[47]對(duì)“Stracchino”軟質(zhì)奶酪進(jìn)行了體外消化試驗(yàn)，通過(guò)半制備反相液相色譜(RPLC)分離消化物，發(fā)現(xiàn)釋放的肽中含2種豐富的六肽(EAMAPK和AVPYPQ)在減少氧化細(xì)胞應(yīng)激、抑制ROS釋放和增加抗氧化反應(yīng)方面表現(xiàn)出顯著的作用。王波[43]31-88利用Caco-2細(xì)胞模型研究了肽組分分子量的大小、電荷性、疏水性對(duì)多肽生物利用度以及消化吸收中跨轉(zhuǎn)運(yùn)路徑的影響，發(fā)現(xiàn)肽組分是弱疏水性時(shí)，它的吸收率和抗氧化性保留率值高，而且生物利用度顯著。深入研究經(jīng)小腸上皮細(xì)胞吸收后的生物利用度對(duì)多肽的利用有重要的意義。

目前為止，有文獻(xiàn)[48]報(bào)道了口服給予分離的蛋白質(zhì)或肽的耐受性良好，沒(méi)有觀察到副作用，因此口服耐受性肽是生成新的營(yíng)養(yǎng)保健品作為藥物替代品的關(guān)鍵點(diǎn)。

4 干酪生物活性肽與腸道菌群關(guān)系

胃腸道菌群與機(jī)體的健康以及免疫調(diào)節(jié)功能息息相關(guān)。干酪中的生物活性肽在胃腸道中可作為氮源供微生物利用，對(duì)于腸道菌群而言是促進(jìn)作用還是抑制作用需深入研究發(fā)現(xiàn)，目前已有關(guān)于干酪肽對(duì)腸道有益菌影響的報(bào)道[49]。

明珠等[50]利用個(gè)體化基因組測(cè)序系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)乳源酪蛋白糖巨肽CGMP促進(jìn)了潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)小鼠腸道菌群的多樣性。其他研究[51]也證實(shí)了CGMP可以作為乳源的生物活性肽應(yīng)用于腸道菌群的調(diào)節(jié)劑或促進(jìn)劑，對(duì)腸道有益菌的生理狀態(tài)具有顯著影響。Charlet 等[52]使用嗜熱鏈球菌和瑞士乳桿菌制作干酪時(shí)，發(fā)現(xiàn)兩者之間有一定的生長(zhǎng)互惠關(guān)系，但是未指明這種互利關(guān)系的關(guān)鍵物質(zhì)。此后程志才等[53]結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)研究得出不具有空間構(gòu)象的QEPV肽能夠很好地被嗜熱鏈球菌所吸收，一定質(zhì)量濃度的QEPV (0.50 mg/mL)能夠顯著促進(jìn)嗜熱鏈球菌的生長(zhǎng)和發(fā)酵，也因此證實(shí)了QEPV肽是嗜熱鏈球菌和瑞士乳桿菌互惠關(guān)系的橋梁物質(zhì)之一。Basiricò等[28]研究了Parmigiano Reggiano干酪消化后的肽組分對(duì)雙歧桿菌和乳酸桿菌的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)多數(shù)肽可被2種菌體特異性地消耗，且雙歧桿菌對(duì)肽組分的消耗更加多樣化且消耗量更大，這些肽組分作為氮源能夠有效促進(jìn)大多數(shù)乳酸桿菌和雙歧桿菌的生長(zhǎng)。但Sedaghatia等[40]在研究β-酪蛋白的纖溶酶消化物的抗菌特性時(shí)發(fā)現(xiàn)消化物中的肽組分除了對(duì)2種致病菌有抑制作用外，2種益生菌(干酪乳桿菌和嗜酸乳桿菌)對(duì)抗菌肽也較為敏感，所以多肽對(duì)有益菌的增殖具有一定的選擇性，并不是促進(jìn)所有細(xì)菌的生長(zhǎng)。因此在食品工業(yè)生產(chǎn)中需要考慮生物活性肽對(duì)多種益生菌是促進(jìn)還是抑制影響。

5 總結(jié)及展望

肽是21世紀(jì)生物應(yīng)用的前沿課題，在功能保健食品和特殊醫(yī)藥食品方面具有廣闊的前景。因此含高營(yíng)養(yǎng)蛋白質(zhì)的干酪是研究多肽的關(guān)鍵點(diǎn)。

干酪生物活性肽經(jīng)蛋白質(zhì)的水解而產(chǎn)生，并表現(xiàn)出多種生物活性，其對(duì)未來(lái)功能性產(chǎn)品的研發(fā)具有重要意義。新序列的干酪多肽不斷被發(fā)現(xiàn)，但是很多研究[21，30，38]并未考慮到小腸吸收的問(wèn)題，即使通過(guò)腸道模擬試驗(yàn)。人體真實(shí)水解環(huán)境以及腸道微生物之間強(qiáng)烈且不可預(yù)測(cè)的競(jìng)爭(zhēng)，需要更加深入的研究與討論。

研究者未來(lái)可借助多種分析手段分離干酪生物活性肽和追蹤肽在體外消化吸收過(guò)程中或人和動(dòng)物血漿中的變化軌跡，以此增加對(duì)特定活性肽的分子機(jī)制和藥物動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的科學(xué)認(rèn)識(shí)，并將完善對(duì)健康的影響機(jī)理。