益生菌與腸道TLR2和TLR4表達相關研究進展

段 玲，周 毅

（1.渠縣畜牧技術推廣站，四川 達州 635200；2.四川農業大學，成都 611130）

天然免疫應答是機體抵御微生物感染的第一道屏障，在動物腸道內微生物數量多達1 014種，腸道微生物被稱之為動物體最大的“免疫器官”[1]。在整個過程中Toll樣受體家族蛋白（TLRs）具有重要的作用[2-3]。TLRs通過識別腸道內容物中各種異物分子啟動信號傳遞過程。這些異物分子可能是病原微生物，也可能是其他蛋白，主要來自腸道中各種微生物或者食源性物質，結構通常是高度保守的和非特異性的病原體相關分子模式（PAMPs）。TLRs完成胞外信號向胞內轉導后，啟動宿主多種細胞產生各種細胞因子，通過一系列炎癥反應抵抗微生物的侵襲[1]。腸道微生態平衡對宿主健康有著密切的聯系，一個平衡的微生態在調節機體免疫、協同宿主代謝等方面具有重要的作用。益生菌通過黏附作用阻斷致病菌的入侵，提供適當的配體和刺激因子影響免疫系統及腸道組織的發育，通過代謝產生揮發性脂肪酸、氨基酸等為宿主提供能量，通過多種多樣的信號傳導方式調節宿主免疫力[4-8]。

益生菌發揮功能是多途徑、多方面的。益生菌通過自身的各種代謝產物調控腸道菌群，達到抑制有害微生物生長，促進有益微生物定植。益生菌還可通過與宿主各個功能細胞相互作用，達到調控宿主生長、代謝和免疫等過程。在宿主識別胞外信號途徑中，包括TLRs在內的各個受體發揮著十分關鍵的作用。TLRs作為益生菌發揮功能過程中重要的一個方面，其變化對宿主健康狀態有著十分重要的影響。所以研究益生菌與腸道TLR2和TLR4之間的關系意義重大。

1 益生菌概述

益生菌簡單來說就是有益的活性微生物，具體是指一類對宿主具有有益功能的活的微生物，其定植于宿主腸道、口腔、生殖系統及皮膚表面，能夠產生一定的有益功效，包括改善宿主微生態平衡、抑制害細菌增殖、協助宿主代謝營養物質、調控宿主免疫系統等功能[9]。因此，益生菌在維持宿主健康狀態，疾病防治等方面發揮著十分重要的作用[10-11]。乳酸桿菌（Lactobacillus）、雙歧桿菌（Bifidobacterium）以及部分芽孢桿菌（Bacillus）芽孢桿菌是目前公認的益生菌菌屬。其通過自身或者分泌酶類協同宿主消化，代謝產物有的可以直接所謂宿主營養和能量來源（揮發性脂肪酸，維生素等），通過抑制病原微生物，促進黏膜修復，參與細胞免疫應答等途徑促進宿主健康。特別是在維持機體腸黏膜屏障功能的完整性方面起重要作用，能夠通過刺激免疫細胞，參與免疫調控過程，并且能夠增強消化道防御屏障，發揮抗炎癥、抗感染的作用[12]。

2 Toll樣受體的發現

TLRs是Lemaitre在研究果蠅胚胎發育時發現的一種跨膜蛋白受體，進一步研究表明，該受體具有細胞信號轉導功能，在感染和免疫應答過程中具有關鍵作用[13]。1997年Janeway等首次發現與Lemaitre發現的果蠅Toll樣受體同源蛋白受體，并將其命名為Toll樣受體4（TLR4）[14]。此后，其他的Toll樣受體被陸續被發現，目前在哺乳動物中已有12個Toll樣受體家族成員被發現。Toll樣受體在進化上十分保守，從線蟲到哺乳動物體內均有表達，其中TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6和TLR10主要分布在細胞表面，其主要識別微生物表面膜上的組分，包括脂多糖、磷壁酸、鞭毛蛋白等；而TLR3、TLR7、TLR8和TLR9在細胞質中表達，主要識別微生物核酸[15-17]。

3 Toll樣受體蛋白結構

TLRs屬于Ⅰ型跨膜蛋白，整個胞外區呈馬蹄形結構，在胞外區結構中富含亮氨酸重復序列（LRR）每個重復序列由24～29個氨基酸組成，能夠特異性的識別PAMPs[18-19]。TLRs跨膜蛋白胞內區域與IL-1 Receptor（IL-1R）家族成員高度同源，因此該區稱為Toll-IL-1受體結構域。TIR結構域含有多個高度保守區域其主要是在細胞信號轉導過程中發揮作用，TIR總共有5種銜接蛋白，包括MyD88、TIR結構域銜接蛋白、誘導IFN-β的TIR結構域銜接蛋白、TRIF相關銜接蛋白和含sterilea與HEAT-Arma dillo的銜接蛋白。TLRs在識別PAMPs過程中，可以利用不同的轉導銜接蛋白，目前已經確定TLR4可以使用所有的銜接蛋白進行信號轉導[20]。

4 TLR-2和TLR-4對應的配體

在TLRs家族中，能夠廣泛識別多種配體，其主要來源于各種病原微生物的組成成分，即病原相關分子模式PAMPs，如脂多糖（LPS）、肽聚糖、胞壁酸、多種細菌和病毒核酸等[21]。目前，因為TLR2和TLR4能夠廣泛識來源于細菌的各種PAMPs，其相關識別和信號轉導過程研究比較深入。TLR2與配體結合通過信號轉導促進腫瘤壞死因子α生成，但是這一過程又會受到TLR6的抑制。TLR2在識別阿拉伯甘露糖、脂蛋白等配體時只有和TLR1或TLR6形成異二聚體才能完成信號轉導過程，而產生的細胞因子反過來會促使TLR2具有更廣泛的識別PAMPs能力[22]。

TLR4可以識別革蘭氏陰性菌細胞壁的主要成分脂多糖（LPS）和壞死細胞釋放的熱休克蛋白（HSP）。腸道中致病性大腸桿菌宿主（革蘭氏陰性菌）或通過其他途徑入侵到血液中時，TLR4將會被激活并識別LPS，LPS不是直接和TLR4結合而是首先與LPS結合蛋白（LBP）形成復合物。隨后，LPSLBP復合物與CD14相互作用后再與細胞表面的TLR4結合，將微生物入侵信號導入胞內。因此，此途徑由LPS、LBP和CD14共同完成TLR4信號轉導過程[23]。除此之外，TLR4還需要髓樣分化蛋白2（MD-2）才能被激活，只有當位于細胞膜上的MD-2與TLR4胞外區連接時，TLR4才能啟動識別LPS復合物[24]。

5 TLR2和TLR4的分布

Takeda等證實，TLRs廣泛分布于動物的各個組織和器官中，但其表達水平各不相同。動物肝、脾、肺、心、腎、腦及胸腺中均有表達，而TLR2、TLR4只在髓源性細胞中表達，如單核巨噬細胞[25]。TLR4分布廣泛，如心肌細胞和微血管內皮細胞、氣道上皮細胞、肺巨噬細胞、腹膜巨噬細胞、庫普弗細胞、脂肪細胞和腸上皮細胞；TLR2分布在細胞表面，如成纖維細胞、星形膠質細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞[26]。聶奎等采用熒光定量的方法研究日本大耳白兔時發現TLR2和TLR4在十二指腸、盲腸、胸腺、脾臟等15個不同組織部位均檢測到TLR2和TLR4，但在骨細胞中未檢測到表達[27]。

6 益生菌與TLR2、TLR4表達

6.1 乳酸桿菌與TLR2、TLR4表達

乳酸桿菌作為一種十分重要的益生菌，其自身代謝產物能夠抑制病原微生物生長。同時，其還可以通過競爭搶占腸黏膜位點，進一步抑制有害微生物的生長[28-29]。Lactobacillus plantarum NDC 75017與Caco-2細胞共培養能夠通過TLR2途徑激活NF-κB信號通路，誘導產生細胞因子達到增強機體免疫作用[30]。Lee等在研究乳酸菌對結腸炎的治療效果時發現，乳酸桿菌可以降低TLR4的表達，降低腸道炎癥反應[31]。研究三硝基苯磺酸（TNBS）誘導的大鼠結腸炎模型時，大鼠出現結腸變短，細胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α表達水平顯著增加。但是給予結腸炎模型大鼠Lactobacillus suntoryeus HY7801干預后，結腸中NF-κB和TLR4表達受到抑制，細胞因子IL-β、IL-6、TNF-α的表達量均出現明顯下調。張琳等使用抗生素構建腹瀉大鼠模型，發現腹瀉發生早期大鼠腸黏膜、脾臟、肝臟中TLR2和TLR4表達顯著降低，腸道微生態系統發生紊亂并導致菌群向其他組織易位，而乳酸桿菌的干預治療可以降低TLR2和TLR4 mRNA轉錄抑制情況的同時減輕細菌易位的程度[32]。反之，給腹瀉小鼠使用大腸桿菌，TLR2和TLR4基因表達量顯著上調，細菌易位程度則會加劇。Lactobacillus casei CRL 431（副干酪乳桿菌CRL431）在保護宿主免受沙門氏菌入侵時，在感染沙門前和感染后補充Lactobacillus casei CRL 431發現TLR2和TLR4表達均上調，感染后停止口服副干酪乳桿菌CRL431也出現表達上調，然而10 d后這兩組TLRs基因表達水平均與對照組相似[33]。由此可見，乳酸桿菌在調節腸道微生態平衡，維持宿主腸道健康方面扮演著十分重要的角色，當腸道微生態失調時TLR2和TLR4表達受到影響，乳酸桿菌干預后腸道微生態朝著有利于宿主健康方向發展，TLR2和TLR4表達相應的也恢復到平衡狀態。因此乳酸菌能夠使TLRs表達、腸道菌群平衡及宿主健康三者之間處于最佳平衡狀態。

6.2 雙歧桿菌與TLR2、TLR4表達

雙歧桿菌有著“長壽菌”之稱，是一種重要的益生菌，目前市售的大多數益生菌飲品及其他產品，都添加了不同菌株的雙歧桿菌。雙歧桿菌參與了宿主的消化、營養、代謝、吸收、免疫及抗感染過程。雙歧桿菌的免疫調節功能尤為突出，尤其在維持機體腸黏膜屏障的完整性方面起重要作用，能夠通過免疫調節、免疫排斥和免疫清除，加強消化道防御屏障，發揮抗炎癥、抗感染的作用[12]。周國華等在研究雙歧桿菌對大鼠末端回腸炎的影響時，發現無論高低劑量都可以引起TLR2和TLR4表達量的下降，從而降低末端回腸炎癥的炎癥反應[34]。王海昆等研究也發現這一現象，非酒精性脂肪肝家兔腸道內大腸桿菌數量與腸黏膜TLR4表達呈正相關性，而雙歧桿菌數量與腸黏膜TLR4表達量呈負相關[35]。研究顯示，給仔豬給予不同劑量的雙歧桿菌后其腸腸道細胞中TLR2表達上調，Khailova以IEC-6（Intestinal Epithelial Cells 6）為模型，在細胞培養液中添加TNF-α和IFN-γ模擬NEC，發現無論是否添加TNF-α或IFN-γ只要與雙歧桿菌共培養在熒光顯微鏡下就能觀察到TLR2的表達，COX-2的表達也隨之增加[36]。而其他未添加雙歧桿菌組則不能觀察到TLR2的表達。這說明TLR2能夠識別革蘭氏陽性菌，也說明雙歧桿菌能夠激活TLR2傳遞相關信息促進COX-2表達，進一步參與炎癥反應。由此可見，雙歧桿菌可以通過與TLRs（主要是TLR2）的相互作用，調動宿主免疫反應為防止病原微生物的入侵，并且利用自身的益生作用維持宿主健康狀態發揮這巨大作用。

6.3 其他益生菌與TLR2、TLR4表達

研究顯示，大腸埃希菌益生菌株Nissle 1917可通過TLR2和TLR4依賴的途徑改善葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導的小鼠結腸炎，丁酸梭菌則可以通過激活TLR2調節的骨髓分化因子88（MyD88）的非依賴性途徑，引起NF-κB、IL-8、IL-6及TNF-α的分泌，以抵抗病原菌的感染同時防止自身免疫紊亂[37-38]。給斷奶仔豬分別灌胃益生菌不拉氏酵母和枯草芽孢桿菌B10，益生菌組腸道發育狀況優于對照組，TLR2、TLR4相關信號蛋白以及信號末端相關細胞因子都出現明顯上調[39]。

7 小 結

益生菌作為腸道正常微生物中重要的組成部分，其與TLRs蛋白家族有著十分緊密的聯系，這是研究益生菌發揮其益生效果的相關分子機制具有十分重要的途徑。近年來更有通過應用雙歧桿菌與TLR2之間的關系來尋找新的炎性因子的報道[40]。因此，研究益生菌與TLRs蛋白家族的關系十分重要。