冰酒發酵遲滯原因的研究進展及解決對策

馬欣娟 孫玉梅 謝詩怡

(大連工業大學生物工程學院，遼寧 大連 116034)

冰酒也稱冰葡萄酒，是一種利用自然冰凍的葡萄釀造的甜葡萄酒[1]。各國的冰酒標準有所不同，加拿大酒商聯盟(Vintners Quality Alliance，VQA)標準規定，必須使用在-8 ℃以下掛在葡萄枝上經過自然冰凍的葡萄，壓榨出的冰葡萄汁的糖度應在320 g/L[1]以上，且酒中殘糖不低于125 g/L，酒精度為7.0%～14.9%，總酸不低于6.5 g/L[2]，這樣的葡萄酒才能稱為冰酒。

冰酒生產工藝使冰酒發酵處于高糖和低溫狀態，酵母在高糖低溫條件下生長和代謝困難，使冰酒發酵可能面臨更多遲緩或停滯的問題。引起發酵遲緩和停滯的原因主要是冰葡萄汁成分和發酵工藝。初糖濃度過高、氮缺乏、發酵溫度過高或過低、SO2過量添加、溶氧量不足及其他因素(陽離子缺乏、乙醇毒性、有機酸和脂肪酸毒性、農藥和殺蟲劑殘留、微生物競爭和不良的釀酒環境)共同作用，使冰酒需發酵數月才能完成[3]。

而發酵遲緩涉及延遲啟酵和降低發酵速度，會影響冰酒品質；發酵停滯則是在達到所需酒精度前酵母停止酒精發酵，從而導致發酵不完全，降低冰酒品質[4]。為了保證冰酒的正常發酵和品質，研究和了解冰酒發酵遲滯的原因至關重要。

1 導致冰酒發酵遲滯的因素

1.1 冰葡萄汁成分

1.1.1 還原糖 還原糖作為冰酒發酵的能源和碳源，其含量對冰酒發酵進程有很大影響。通常每生成體積分數1%的酒精需要消耗17～18 g/L糖，葡萄汁中初糖濃度高于180 g/L時，才能獲得酒精度為10%的葡萄酒[5]58-60。原料初糖濃度的增加會明顯延長發酵周期[3]，由于發酵冰酒所用的葡萄是經過冰凍濃縮的，因此其中的還原糖濃度通常>360 g/L。當初糖濃度>400 g/L時，會提高發酵環境的滲透壓，導致部分酵母菌失水萎縮，影響酵母菌的生長和代謝，造成發酵遲滯；當初糖濃度>520 g/L時，過高的滲透壓會使大部分酵母細胞失水死亡，導致冰酒發酵遲滯[6-7]。在冰酒發酵過程中，糖分子移動到酵母細胞中需要首先結合轉運蛋白[8]。轉運蛋白(高親和力轉運蛋白)是具有多個底物識別或結合位點的開放結構，在初糖濃度低時這些轉運蛋白能夠從多個位置識別和結合糖；在初糖濃度高的情況下，當多個糖分子試圖同時結合具有多個底物識別位點的轉運蛋白時，就會堵塞轉運蛋白，因此糖分子無法轉移到細胞中，糖的總攝取速率降低，從而導致發酵遲滯[8]。

與葡萄糖相比，高濃度的果糖對酵母的生長具有抑制作用，且果糖的利用率相對較低，原因可能與己糖激酶Ι活性水平的缺乏有關[9]。已有研究[10]表明，添加果糖使葡萄糖果糖比(Glucose to Fructose Ratio，GFR)增大會抑制正在進行的發酵，而添加葡萄糖使GFR>1可以促進正在進行的發酵。

因此，對糖濃度過大的濃縮葡萄汁，需要先稀釋葡萄汁再進行冰酒發酵，避免發酵遲滯。

1.1.2 可同化氮 冰葡萄汁中有有機氮和無機氮兩類氮源，其中能被酵母利用的氮源統稱為酵母可同化氮(Yeast Assimilable Nitrogen，YAN)[11]。冰葡萄汁的可同化氮含量過低時，酵母菌無法正常繁殖代謝，易造成發酵遲滯；氮含量過高時，會使發酵液中有害微生物繁殖，影響發酵進程并生成對冰酒產生不利影響的代謝產物，影響冰酒品質。通常認為，酵母發酵達到酒精度7%至少需要150 mg/L·YAN，適宜發酵的可同化氮含量為200～500 mg/L·YAN，超過500 mg/L·YAN則被視為過量[12]。

由于冰酒葡萄汁中糖濃度過高，YAN往往無法滿足酵母菌正常發酵，會使發酵停滯。初糖濃度為320～370 g/L 的長相思和賽美容冰葡萄汁，在可同化氮含量為50～300 mg/L發酵時，商業釀酒酵母ST的最大菌濃與可同化氮含量呈正比，且發酵時間隨可同化氮含量提高而大幅縮短[13]。原料葡萄汁的可同化氮含量與葡萄品種也有關，釀造冰酒的葡萄品種主要有雷司令、威代爾、霞多麗、貴人香、米勒、瓊瑤漿、白品諾、灰品諾、美樂、長相思等[14]，其中，霞多麗進行冰酒發酵遲滯的原因與糖濃度無關，而是其可同化氮含量較低(140 mg/L)所致[15]。

糖轉運蛋白在細胞穩定期保持高效轉運[16]，必須提供可同化氮以持續再合成糖轉運蛋白。由于高濃度乙醇會抑制氨基酸和其他氮的運輸，所以在發酵前期必須提供氮源并貯藏在液泡中以備后續使用。不同菌株在發酵穩定期的氮需求差異顯著，其差異遠大于生長的氮需求差異。在釀酒條件下葡萄汁中的高濃度銨可能會抑制葡萄酒菌株對氮的高效利用和生物量的生成[17]。在發酵穩定期添加特定氨基酸可以延長最大發酵活性周期，而銨無此作用，添加氨基酸(尤其是甘氨酸)可以增強糖轉運蛋白等被降解蛋白的快速合成能力[18]。可見，適宜的氮營養對完成釀酒條件下的發酵非常重要，必須保持含氮化合物對最佳利用和生長的平衡。

基于上述分析，為避免冰酒發酵遲緩，必須保證葡萄汁在發酵前期含氮充足，在發酵過程中添加甘氨酸等氨基酸并控制銨含量不能過高。

1.1.3 其他成分 葡萄種植過程中，葡萄藤可以通過其根系或通過與含有金屬離子(銅、鐵)的殺真菌劑直接接觸來吸收少量重金屬并傳遞到葡萄中，會抑制酵母細胞生長，進而影響冰酒發酵[19]。

海藻糖可以保護酵母細胞免受滲透壓脅迫和乙醇毒性，提高酵母細胞活力[20]。葡萄汁中海藻糖含量豐富[21]。因此，防止冰葡萄汁中海藻糖流失可以提高細胞活力和發酵速率。

1.2 發酵工藝

1.2.1 溫度 冰酒發酵過程的溫度控制與冰酒的品質有著極其密切的關系。不同酵母菌株所需的發酵溫度不同。采用商業酵母菌株K1-V1116對威代爾冰葡萄汁發酵時，在溫度低于5 ℃時會抑制酵母菌活性，造成發酵遲緩，而溫度高于10 ℃時，乙醇的生成量隨溫度升高明顯增加[3]。釀酒酵母Y-1# 在10～20 ℃發酵威代爾冰葡萄汁時，隨發酵溫度的升高，發酵周期明顯縮短，乙醇、乙酸和耗糖量均增加[22]。葡萄酒酵母CICC 31604在20，25，30 ℃發酵北冰紅冰葡萄汁，發現20 ℃和30 ℃均會抑制酵母生長，使發酵遲緩、耗糖和乙醇產量較低，冰酒感官評定較差[23]。

在冰酒發酵過程中，較低溫度會降低細胞膜的流動性并限制轉運蛋白的構象變化，而高溫會增加細胞膜的流動性并在構象變化過程中導致轉運蛋白結構的過度解離，進而影響發酵速率[8]。發酵罐中葡萄汁的溫度可能不均勻，靠近罐壁的溫度較低，而靠近罐中心的溫度較高。應避免發酵溫度高于30 ℃，以防由于菌株的發酵速率和系統的傳熱能力使發酵溫度快速升高到抑制發酵的程度，引起發酵停滯[8]。在發酵后期溫度會下降，過度冷卻也會導致發酵停滯，應避免在劇烈發酵結束后罐體持續冷卻而發生的劇烈降溫(使溫度波動不宜超過5 ℃)。不同酵母菌株的發酵溫度應保持在22～25 ℃。

1.2.2 酵母菌種及其使用方法 冰酒的自然發酵周期較長，為保證發酵的順利進行和冰酒品質的穩定，工業生產中通常采取接種商業酵母的方法發酵冰酒。Daniel等[24]采用7種商業酵母進行冰酒發酵，發現不同酵母菌種發酵速率不同，快者17 d而慢者長達數月才能完成發酵。Bely等[25]分別使用非釀酒酵母Torulspora.delbrueckii(27828和31703)和釀酒酵母ST發酵初糖濃度為360 g/L的葡萄漿，發現T.delbrueckii菌株的發酵周期較長(20 d和26 d)，且具有較低的乙醇和乙酸產量，而釀酒酵母ST僅11 d就完成發酵。

現代葡萄酒生產通常采用活性干酵母，活性干酵母在使用前需適當的復水馴化以提高酵母活力，進而縮短發酵周期。復水溫度直接影響了酵母的活力，40 ℃復水，酵母細胞內的海藻糖會提高酵母細胞活力。但無論酵母細胞內的海藻糖水平如何，低于40 ℃復水會導致細胞質內容物進入復水介質，使酵母細胞死亡率升高，造成發酵遲滯。60 ℃復水，會造成細胞膜的脂質雙分子層從干凝膠到液晶相的相變，導致細胞質內容物損失，細胞活力降低[26-27]。對商業酵母菌株K1-V1116直接接種和逐步復水馴化后接種，發酵結果表明直接接種的酵母生長較慢、耗糖和乙醇產量較少，發酵遲緩；復水馴化后接種的酵母生長較快、耗糖和乙醇產量較多，發酵進程加快[3]。

酵母菌種的接種量也與發酵遲滯有關。采用釀酒酵母 Y-1#、Y-2# 和 Y-3# 發酵初糖350 g/L的威代爾冰葡萄汁，接種量為0.3 g/L的發酵周期較長，而接種量為0.5 g/L的發酵周期較短[22]。

冰酒發酵的糖度較高且溫度較低，需要選擇耐高糖、耐低溫、生長繁殖速度快、啟酵早、揮發酸和有機酸生成量低的酵母以提高細胞活力，減少葡萄酒中有害代謝產物的積累，縮短發酵周期[28]405-408[29-31]。除選取適合冰酒發酵的酵母外，發酵前通常要對酵母菌進行梯度馴化或復水，且酵母的復水溫度保持在40 ℃為宜。當糖度高于 5 °Brix時，應將標準接種量0.25 g/L提高至0.35 g/L以上，以達到快速啟酵的目的并保證發酵完全[6]。

1.2.3 二氧化硫添加量 冰酒發酵過程中添加SO2可以起到抗氧化、降酸、護色、澄清和抑制微生物生長等重要作用，影響葡萄酒的感官品質[32]。SO2在葡萄酒釀造過程中最大使用量為250 mg/L，適量SO2可以與乙醛及其他相似物結合，降低酒中乙醛含量及過氧化味，產生令人愉悅的香氣，從而改善冰酒風味[33]。過量使用SO2會產生刺激性的H2S氣體，抑制酵母的生長繁殖，導致發酵遲滯，還會影響人體健康[5]131-137。SO2可以抑制蘋果酸—乳酸發酵，從而降低冰酒發酵時揮發酸的生成量，當冰葡萄汁的初始糖度為350～400 g/L時，隨SO2添加量(30～150 mg/L)升高，發酵周期明顯延長[34]。當發酵到冰酒所需酒精度時，可以通過添加150～200 mg/L的SO2終止發酵。

1.2.4 溶氧量 酵母菌生長繁殖需要氧氣。發酵液初始溶氧量影響酵母菌的繁殖，從而影響發酵周期。在冰酒發酵的高糖低溫環境中，可以通過攪拌提高溶解氧量至7～8 mg/L，有助于酵母菌快速的生長繁殖[28]362-365[35]。酵母厭氧發酵產乙醇，發酵液中溶氧量過高會使酵母菌不停繁殖，而延遲啟動酒精發酵，推遲發酵進程；此外，溶氧過量還會影響冰酒質量，特別是對風味物質(如花香和果香)造成不可逆的損失[14]。Fornairon等[36]研究表明，溶氧量過少時，霞多麗葡萄汁的發酵遲緩。

2 發酵遲滯引起的冰酒成分變化

2.1 甘油

甘油具有甜味和黏性，高于5.2 g/L時可以產生甘甜感，還可以中和葡萄酒中的辣感和苦味，影響酒體厚度，從而改善冰酒感官質量。因其無揮發性、無氣味，所以不會對葡萄酒的香氣造成影響。冰酒發酵的高滲透壓會刺激酵母產生較多甘油來保護自身。酵母甘油代謝主要由甘油三磷酸脫氫酶催化，高滲透壓會正向調節編碼甘油三磷酸脫氫酶的基因ALD3的表達，致使甘油生成量增加[6]。當初始糖含量由230 g/L增加到450 g/L時，甘油由8.1 g/L增加到11 g/L，發酵周期由7 d延長到50 d，說明初始糖度越高，發酵周期越長，生成的甘油越多[22]。

2.2 乙醇

乙醇產量是判斷冰酒發酵程度的重要指標。發酵的乙醇產量隨初始糖含量和酵母接種量的增加而增加。當初始糖含量由230 g/L增加到450 g/L時，發酵周期由7 d 延長到50 d，乙醇量由13.9%降到9.0%[22]。用初始糖含量為400～460 g/L的葡萄汁釀造冰酒，發現乙醇從11.9%降低到6.3%[37]。可見，較高的初糖含量會引起發酵遲緩，影響酵母的糖代謝能力，導致乙醇產量不足，影響冰酒品質。采用直接和逐步馴化的商業酵母菌株K1-V1116接種發酵，接種量為0.2 g/L和0.5 g/L，在達到所需乙醇水平(11%)之前，低接種量的發酵停滯，乙醇產量較低(7.8%和8.1%)，而高接種量的發酵正常，且乙醇產量較高(10.5%和12.0%)[6]。研究[24]發現非釀酒酵母T.delbrueckii的發酵周期較長，且僅產生7.4%乙醇，而釀酒酵母ST的乙醇產量達15.1%。

可見，較高的初糖含量、較低的酵母接種量和非釀酒酵母菌種會引起發酵遲緩，影響酵母的糖代謝能力，導致乙醇產量不足，影響冰酒品質。

2.3 乙酸

酒精發酵的副產物以乙酸為主，乙酸含量過高會嚴重危害葡萄酒質量，故其含量通常較低(0.25～0.50 g/L)。初糖濃度較高的葡萄漿發酵生成的乙酸含量較高，超過EEC(歐洲經濟共同體)法定的1.5 g/L[13]。冰酒發酵產乙酸的量受溫度、菌種、接種量、可同化氮含量和初糖濃度影響。

將貴腐葡萄的初糖濃度從189 g/L增加到391 g/L，會使其所釀葡萄酒的乙酸濃度從0.56 g/L升高到1.46 g/L。可見，葡萄漿的高糖濃度會抑制酵母生長，生成大量乙酸[13]。

在低氮情況下，補加銨鹽能顯著降低乙酸生成；初始氮高于200 mg/L會增加乙酸的生成，建議葡萄漿的適宜氮濃度是190 mg/L。在接種前補加氮會使乙酸生成量降低18%～27%，在耗糖低于50 g/L時補加氮會使乙酸終濃度增加，超過發酵控制的水平[38]。

在酵母生長平衡期補加氮會激活己糖轉運系統，提高發酵速率和乙酸生成速率，此過程沒有因生成生物量而獲得多余的NADH補償[39]；補加氮量超過190 mg/L也有相似的機制，氮過量增加了發酵速率，卻沒有相同程度地促進生物量生成，而是直接增加了乙酸生成量[40]。

2.4 高級醇和酯類

高級醇是冰酒的主要呈味物質，主要包括正丙醇、異丁醇、異戊醇等。適量的高級醇可以賦予葡萄酒特殊的風味和香氣[12]，過多的高級醇則會給葡萄酒帶來異味，并易使人頭疼和醉酒。Chizuru等[41]發現用釀酒酵母Kyokaino.701發酵明顯遲緩，且異戊醇含量明顯升高，影響了冰酒的香氣。用初糖含量為24.5 °Brix和46 °Brix的葡萄汁發酵，生成的異丁醇、苯甲醇、2-苯乙醇、2-己烯醛和5-甲基糠醛隨初糖含量升高而明顯升高[42]。可見，葡萄汁初糖含量與高級醇的生成量密切相關。隨著葡萄汁初糖含量增加，葡萄酒中的γ-己內酯和γ-丁內酯量以及大部分酯類和酚酸類香味物質含量增加，葡萄酒的品質提高[43-44]。由于初始糖濃度決定發酵狀態，可以推測，發酵遲滯也將影響高級醇和各類酯類物質的生成量，從而影響冰酒的品質。

2.5 糖

冰酒釀造的初糖含量直接影響發酵終點冰酒的殘糖量。酵母在不良環境條件下通常耗糖緩慢，并且在高殘糖濃度下停滯發酵[8]。在高糖和低溫條件下發酵得到的冰葡萄酒中潛在殘糖量較高。VQA(加拿大酒商質量聯盟)規定冰酒中殘糖≥125 g/L，酒精度為7.0%～14.9%，酸度≥6.5 g/L。中國規定冰酒殘糖≥120 g/L，酒精度7.0%～14%，酸度≥6.5 g/L，此標準保證了冰酒中糖、酒精度、酸的平衡性[45]。

3 結論和展望

迄今為止的研究表明，造成冰酒發酵遲滯的原因主要為冰葡萄汁成分和發酵工藝不當。為保證冰酒發酵順利，避免遲滯，應適當控制冰葡萄汁中主要成分含量和釀造工藝。控制冰葡萄汁中初糖濃度≤40 °Brix，果糖濃度過高時可添加葡萄糖促進發酵；保證葡萄汁足夠的含氮量，一般在200～500 mg/L，但銨含量不能過高，可以通過在發酵穩定期添加甘氨酸促進發酵，在耗糖高于50 g/L 時補加氮降低乙酸產量。此外，冰酒發酵需要選育耐高糖、耐低溫、生長繁殖速度快、啟酵早、乙酸生成量低的酵母；對于采用活性干酵母的冰酒發酵，接種前應在40 ℃復水馴化活性干酵母，并適當提高接種量。冰酒發酵的SO2添加量不宜超過250 mg/L，且應維持7～8 mg/L 的溶氧量。發酵溫度應保持在22～25 ℃，且避免發酵后期較大的溫度波動。

目前對于冰酒發酵遲滯的研究主要集中在原料成分、發酵工藝等原因的分析和對冰酒成分的影響，至于其他如非增殖性營養、植物酚類化合物和植物抗毒素對酵母生長和發酵速率的影響及其分子作用機理也值得研究。酵母基因組測序以及用于全基因組和蛋白質組分析表達圖譜技術的出現，可以促進了解冰酒發酵遲滯的酵母生物學[46]，從而為改善冰酒發酵遲滯問題提供更好的診斷工具。