紅曲黃酒糟蛋白酶解物制備工藝優化及營養評價

林曉婕 何志剛 梁璋成 沈 萍 林曉姿 李維新

(福建省農科院農業工程技術研究所；福建省農產品(食品)加工重點實驗室，福州 350003)

紅曲黃酒是福建特產，目前福建省共有黃酒生產企業119家，年生產能力12.50×107L，在生產過程中能產生20%～30%的酒糟[1]，即產生2.5萬t以上的紅曲黃酒糟。紅曲黃酒糟干基中含有20%～40%的蛋白質，其中以水不溶性的谷蛋白為主。此外，酒糟中還含有大量的霉菌、細菌、酵母等微生物及其自身的代謝產物。大米經過釀制，清蛋白所占比例略微提高，而球蛋白和谷蛋白所占比例降低，且不能完全溶解在堿溶液[2-3]。因此，相對于大米蛋白，黃酒糟中的蛋白溶解性較低，含有不溶性物質多，難以直接利用。利用酶解技術可將黃酒糟制成易于吸收利用的水解蛋白，可極大地提高產品的附加值，具有很好的經濟和社會效益。

黃酒按釀造黃酒所使用的曲種分為麥曲黃酒和紅曲黃酒。麥曲黃酒采用麥曲(添加量10%左右)、秈米或粳米為原料[4]，而紅曲黃酒采用紅曲(添加量2%～4%)、糯米為原料[5]。原料差異和釀制工藝的不同導致了麥曲黃酒糟和紅曲黃酒糟成分的不同。麥曲黃酒糟蛋白質質量分數約為30%左右。舒進等[6]采用木瓜蛋白酶提取麥曲黃酒糟蛋白，未考慮酒糟中纖維素、淀粉等對蛋白質提取的影響。樓芳菲等[7]、左楠楠等[1]等采用堿性蛋白酶提取麥曲黃酒糟蛋白，未考慮酶解產品的風味及其應用。本實驗所采用的紅曲黃酒糟蛋白質質量分數約為40%，綜合考慮纖維素、淀粉等物質的利用以及酶解產品的風味。通過項目組前期實驗發現，添加纖維素酶、α-淀粉酶不僅可以酶解酒糟中的部分纖維素和淀粉轉化為多糖，還可以釋放出纖維和淀粉中包裹著的蛋白。因此，先進行纖維素酶、淀粉酶酶解后，再進行蛋白酶酶解，并通過酶解條件優化，提高蛋白的提取率，綜合考慮紅曲黃酒糟蛋白酶解物風味并對其進行營養評價，該蛋白酶解物可開發為優質的功能營養食品、調味品等。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

福建紅曲黃酒糟，60 ℃烘干粉碎后備用，蛋白質質量分數38.2%，含水量10.3%，福建寧德黃家酒業。

纖維素酶(40 000 U/g)，α-淀粉酶(40 000 U/g)，堿性蛋白酶(200 000 U/g)、中性蛋白酶(200 000 U/g)、木瓜蛋白酶(200 000 U/g)、風味蛋白酶(15 000 U/g)、胃蛋白酶(10 000 U/g)，江蘇銳陽生物科技有限公司。其他試劑均為分析級。

1.2 儀器與設備

Sorvall LYNX 6000高速落地離心機；DHG-9070型電熱恒溫鼓風干燥箱；UV-1750紫外可見分光光度計；ZDJ-400H滴定儀；Foss 2000自動凱氏定氮儀。

1.3 方法

1.3.1 紅曲黃酒糟的前處理

以紅曲黃酒糟和水固液比1∶10混合，先以纖維素酶酶解，反應pH 5，溫度65 ℃，時間0.5 h，再以α-淀粉酶酶解反應pH 6.0，溫度70 ℃，時間2 h。

1.3.2 蛋白酶的篩選實驗

1.3.2.1 單酶酶解

取經前處理后的紅曲黃酒糟，分別采用堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、風味蛋白酶、胃蛋白酶進行酶解，pH、溫度均按說明書推薦參數操作，酶解時間2 h，加酶量2 000 U/g，10 000 g離心15 min后收集上清液，測定蛋白含量。

表1 不同蛋白酶對蛋白提取率的影響

1.3.2.2 復合酶解

復合方式為：堿性蛋白酶+風味蛋白酶、中性蛋白酶+風味蛋白酶、堿性蛋白酶+風味蛋白酶，比例均為1∶1，加酶量2 000 U/g，10 000 g離心15 min后收集上清液，測定蛋白含量。

1.3.3 酶解工藝優化

1.3.3.1 復合蛋白酶酶解單因素實驗

取經前處理的紅曲黃酒糟，以復合酶比例(中性蛋白酶：風味蛋白酶)、固液比、pH、溫度、時間和加酶量作為單因素，研究單因素對蛋白提取率的影響。

1.3.3.2 響應面優化設計

以蛋白提取率為指標，在四因素三水平上對pH、溫度、時間、加酶量進行響應面優化。實驗因素與水平見表1。

表2 實驗設計因素及水平

1.3.4 紅曲黃酒糟蛋白酶解物的感官評價

參照王雨生等[8]，采用綜合評分法對紅曲黃酒糟蛋白酶解物進行感官評價。感官評價由12位具有感官評定經驗的食品專業人員，采用評分法對紅曲黃酒糟蛋白酶解物的整體滋味進行評價。設定5個評價指標及權重系數，整體滋味通過加權法將各個指標的平均分加權相加，得出評分。評價標準：鮮味、香味、紅曲黃酒糟特征風味、甜味、協調性評分均為0～5分，0分表示完全無鮮味、香味、紅曲黃酒糟特征風味、甜味以及協調性差；分值越大，表示各指標越優，整體滋味越好。指標權重均為20%。

1.3.5 紅曲黃酒糟蛋白酶解物的營養評價

化學評分(chemical score，CS)：參照聯合國糧農組織(Food and Agriculture Organization of the United，FAO)的方法[9]。

氨基酸評分(amino acid score，AAS)：樣品中必需氨基酸質量分數占FAO和世界衛生組織(World Health Organization，WHO)模式中相應氨基酸質量分數的比例[9]。

必需氨基酸指數(essential amino acid index，EAAI)：樣品蛋白質中各種必需氨基酸含量與標準蛋白質中相應的各種氨基酸含量之比的加權平均值[10]。

生物價(biological valence，BV)：BV=1.09×EAAI-11.7。

營養指數(nutritional index，NI)：EAAI與蛋白質質量分數的乘積[11]。

氨基酸比值系數分(score of ratio coefficient ofamino acid，SRCAA)：參照陳麗麗等[11]的方法進行測定。

1.3.6 檢測方法

1.3.6.1 蛋白質含量：參照GB 5009.5—2016食品中蛋白質的測定方法。

1.3.6.2 肽含量：參照朱俊穎[12]等方法測定。

適量取2種粉碎樣品,將少許微膠囊粉末撒于貼了雙面膠的樣品臺上,吹去多余粉末,噴金30 s后用高分辨場發射掃描電子顯微鏡觀察樣品形態并拍照。

1.3.6.3 氨基酸分析：采用GB/T 5009.124—2003食品中氨基酸的測定中所列方法測定氨基酸含量。

1.3.7 數據處理

使用DPS3.01、Design-Expert.V8.0.6軟件進行數據處理。

2 結果與分析

2.1 紅曲黃酒糟的預處理

以纖維素酶和淀粉酶預處理紅曲黃酒糟，可使原料結構松散，釋放被束縛的大多數水溶性蛋白，并使得淀粉酶和蛋白酶能夠進入內部促進蛋白的降解和溶解[13-14]。大米蛋白存在于淀粉顆粒的外表面或填充在淀粉顆粒中，通過二硫鍵形成網絡結構，與淀粉緊密結合[15-16]。α-淀粉酶可水解淀粉，部分糖類物質與不溶性蛋白質分離，蛋白質并未水解，但其網絡結構在淀粉酶解的過程中顯示出蛋白凝膠體的骨架，使得蛋白的作用位點暴露更有利于蛋白酶的作用。蛋白酶酶解將蛋白水解成短肽，打開蛋白的二級結構，肽鏈展開，使得更多的親水集團暴露，從而促進了蛋白溶出[17-18]。經對比實驗，可提高蛋白提取率9.72%。

注：C：蛋白酶；A+C：纖維素酶+蛋白酶；B+C：淀粉酶+蛋白酶；A+B+C：纖維素酶+淀粉酶+蛋白酶圖1 不同預處理對蛋白提取率的影響

2.2 蛋白酶的篩選結果

2.2.1 單酶酶解

由圖2可見，各蛋白酶對酒糟蛋白水解能力之間存在較大差異，堿性蛋白酶、中性蛋白酶和風味蛋白酶的的蛋白提取率較高，分別達50.63%、47.04%和44.71%，與其他各處理間的差異均達極顯著水平(P<0.01)。谷蛋白占大米蛋白的70%～90%，分子內和分子間廣泛存在的二硫鍵以及分子內存在的巰基，交聯凝聚形成谷蛋白，因此，造成谷蛋白較低的水溶性[19-21]。通過蛋白酶的降解和修飾，對蛋白分子在不同位點進行切割，二硫鍵打開，蛋白降解為可溶性多肽和部分氨基酸，溶解性得到改善。由于堿性蛋白酶具有廣泛的消化位點，因此具有較好的酶解效果[22]。堿性蛋白酶酶解液具有較好的鮮味，但香味等其他感官指標評分不佳，導致整體滋味一般。中性蛋白酶酶解液和風味蛋白酶酶解液，兼具較好的提取率和感官評分。因此，后續實驗采用堿性蛋白酶分別和中性蛋白酶、風味蛋白酶復合，中性蛋白酶和風味蛋白酶復合，以期獲得更優的蛋白提取率和改善酶解液風味。

注：橫坐標1～5分別為堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、風味蛋白酶、胃蛋白酶圖2 蛋白酶對蛋白提取率和感官評分的影響

2.2.2 復合酶酶解

復合酶解實驗結果如圖3所示。圖3表明，中性蛋白酶和風味蛋白酶的復合酶解提取率達47.97%，高于中性蛋白酶和風味蛋白酶單酶提取率，達極顯著(P<0.01)水平。同時，酶解液具有較好的鮮味、香味、紅曲黃酒糟特征風味，整體協調性較好，與兩種單酶酶解風味比較，具有更好的整體滋味。中性蛋白酶和風味蛋白酶雖然能一定程度改善堿性蛋白酶酶解液風味，但效果不顯著。同時，由于兩種酶均不處于最適酶解條件，或者只有一種酶處于最適酶解條件，導致蛋白提取率較低。因此，后續實驗采用中性蛋白酶和風味蛋白酶復合酶解并進行優化。

注：橫坐標1～3分別為堿性蛋白酶+風味蛋白酶、中性蛋白酶+風味蛋白酶、堿性蛋白酶+中性蛋白酶圖3 復合蛋白酶對蛋白提取率和感官評分的影響

2.3 蛋白酶酶解單因素實驗設計

黃酒糟經纖維素酶、淀粉酶處理后，在不同的復合酶比例(中性蛋白酶：風味蛋白酶)、固液比、pH、溫度、時間和加酶量條件下使用復合酶酶解，研究不同酶解條件對蛋白提取率的影響。實驗結果見圖4。

圖4 各因素對蛋白提取率的影響

圖4表明，復合酶比例(中性蛋白酶：風味蛋白酶)對蛋白提取率的影響呈先上升后下降的趨勢，當中性蛋白酶：風味蛋白酶為2∶1時，蛋白提取率達54.64%。隨著固液比的降低，蛋白提取率呈先快速上升后趨于平緩的趨勢。當固液比為1∶10和1∶12時，有利于酶與底物反應充分，蛋白提取率分別達54.64%和55.72%，差異未達顯著水平(P>0.05)，綜合經濟成本考慮，適宜的固液比為1∶10。隨著pH的上升，蛋白提取率呈先上升后下降的趨勢，pH值7.0的處理蛋白提取率最高。溫度為50 ℃的處理蛋白提取率最高，達54.64%，各處理間差異均達極顯著水平(P<0.01)。當溫度超過50 ℃，蛋白酶活性逐漸失活，酶解度降低。隨著酶解時間的延長，蛋白提取率呈先快速上升后趨于平緩的趨勢。酶解時間2 h與3 h的蛋白提取率無顯著差異。隨著固液比的降低，蛋白提取率呈先快速上升后趨于平緩的趨勢。隨著加酶量的增加，蛋白提取率呈先快速上升后趨于平緩的趨勢，當加酶量為2 500 U/g時，蛋白提取率為59.41%，與加酶量3 000 U/g處理的61.04%差異不顯著(P>0.05)。從經濟成本考慮，適宜的蛋白酶加酶量為2 500 U/g。

2.4 響應面優化實驗設計

2.4.1 Box Behnken設計與結果

根據Box Behnken設計原理，在pH、溫度和時間、加酶量上進行29個實驗點的響應面分析實驗。實驗方案和結果見表3。

表3 響應面法實驗方案及結果

2.4.2 二次回歸模型與方差分析

利用Design Expert 8.0.5軟件進行多元回歸擬合分析，建立蛋白提取率對pH、溫度、時間、加酶量4個自變量的二次多項式回歸模型，回歸系數R2=0.984 7。

Y=+59.42-3.12X1+0.88X2+2.87X3+1.99X4-1.65X1X2-1.85X1X3-0.40X1X4+0.45X2X3+0.93X2X4+0.20X3X4-3.48X12-4.12X22-2.31X32-2.24X42

方差分析結果見表4。該模型達到極顯著水平(P<0.01)，失擬項不顯著，回歸效果好，可信度高。4個因素對綜合值影響主次順序：X1(pH)>X3(時間)>X4(加酶量)>X2(溫度)，均達到極顯著水平。交互項X1X2、X1X3對蛋白提取率的影響極顯著，交互項X2X4對蛋白提取率的影響顯著。

2.4.3 交互作用因子分析

交互項中pH和溫度、pH和時間對蛋白提取率的影響極顯著(P<0.01)，溫度和加酶量對蛋白提取率的影響顯著(P<0.05)。等高線圖的橢圓形排列較密集，說明因素變化對響應值影響較大，若調整pH、溫度、加酶量至最適水平，應可顯著提高蛋白提取率。

表4 回歸模型方程方差分析

注：**表示極顯著(P<0.01)，*表示顯著(P<0.05)。

2.4.4 最佳工藝預測與驗證

黃酒糟蛋白與大米胚乳蛋白相似。大米胚乳蛋白由60%～65%的PB—Ⅱ型蛋白、20%～25%PB—I型蛋白以及10%～15%清蛋白組成[15]。采用中性蛋白酶和風味蛋白酶復合酶解PB—Ⅱ型蛋白和清蛋白，具有較好的酶解效果。通過利用Design Expert 8.0.5軟件模型進行優化，計算得出最佳的工藝參數為：pH 6.15，溫度52.0 ℃，時間3 h，加酶量2 825 U/g在此條件下，蛋白提取率為63.06%。為了驗證模型預測結果的準確性，在模型優化的工藝參數下進行實驗，3次重復，蛋白提取率分別為63.75%、63.64%、63.47%，平均值63.62%，模型擬合度較好。

2.5 黃酒糟蛋白酶解物的營養評價及風味氨基酸

黃酒糟蛋白酶解物中非需氨基酸質量分數分別為天門冬氨酸10.90%、谷氨酸14.30%、絲氨酸5.42%、組氨酸2.36%、精氨酸4.97%、甘氨酸6.04%、脯氨酸5.37%、丙氨酸5.32%。黃酒糟蛋白酶解物中必需氨基酸質量分數及營養評分表如表5。黃酒糟蛋白酶解物18種氨基酸總質量分數為88.91%，第一限制性氨基酸為色氨酸，占總氨基酸的0.75%。黃酒糟蛋白酶解物中必需氨基酸占總氨基酸的41.30%。在必需氨基酸中質量分數最高為亮氨酸8.36%。表5表明，除蛋氨酸、半胱氨酸和色氨酸以外，各必需氨基酸CS較大，與標準雞蛋蛋白的對應必需氨基酸組成接近。由于谷物中賴氨酸含量低，且在加工過程中易被破壞，故賴氨酸為大部分谷物的第一限制性氨基酸，同時賴氨酸也是人體的第一必需氨基酸。黃酒糟蛋白酶解物中賴氨酸AAS較高，這可能是因為，在紅曲黃酒發酵過程中微生物代謝產生。賴氨酸具有協助人體吸收利用其他營養物質、促進生長發育、增強免疫功能、提高中樞神經組織等重要功能[10]。因此，黃酒糟蛋白酶解物營養均衡優于谷物。黃酒糟蛋白酶解物的EAAI、BV、NI分別為76.52、71.70、74.99，說明黃酒糟蛋白酶解物可被機體吸收利用程度較高。SRCAA為79.03，表明黃酒糟蛋白酶解物中各種必需氨基酸偏離模式氨基酸的離散度較小，營養價值相對較高，可以確定黃酒糟蛋白酶解物為一種優質的蛋白來源。

黃酒糟蛋白酶解物中鮮味氨基酸(天門冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸)和甘氨酸總質量分數達53.50%，具有良好的鮮味和甘味，可用于開發高檔風味調味品以及作為功能食品添加劑等。肽含量達22.4 g/L，優于分段水解，后續可進行多肽調味液的研發。

表5 氨基酸組成與評分

3 結論

研究結果表明，最佳酶解工藝為：以紅曲黃酒糟和水固液比1∶10，以纖維素酶和淀粉酶酶解預處理黃酒糟，選用中性蛋白酶和風味蛋白酶以2∶1比例復合后，在pH 6.15，溫度52.0 ℃，時間3 h，加酶量2 825 U/g條件下酶解，蛋白提取率達63.62%。黃酒糟蛋白酶解物中鮮味氨基酸(天門冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸)和甘氨酸總質量分數達53.50%，具有良好的鮮味和甘味。黃酒糟蛋白酶解物必需氨基酸指數、生物價、營養指數和氨基酸比值系數分分別為76.52、71.70、74.99、79.03，營養均衡、合理，是一種優質的蛋白質資源，可用于開發高檔調味品以及作為功能食品添加劑等。