以金屬有機框架材料為基質免疫磁珠的制備及在玉米樣品檢測中應用

孫毅蒙 丁 軻 韓 濤 陳湘寧

(北京農學院食品科學與工程學院1，北京 102206 )(食品質量與安全北京實驗室2，北京 102206)(農產品有害微生物及農殘安全檢測與控制北京市重點實驗室3，北京 102206)

金屬-有機框架(Metal-Organic Frameworks)，簡稱MOFs，是由有機配體和金屬離子或團簇通過配位鍵自組裝形成的具有分子內孔隙的有機-無機雜化材料[1-3]。該類材料將無機金屬節點與有機框架通過配位鍵結合在一起，形成了多種多樣的結構，并由此導致其具有豐富的性質，從而在諸多領域都有良好的應用前景[3-4]。應用于樣品前處理的金屬有機框架材料主要有IRMOF類、MIL類、UiO類、ZIF類和金屬有機框架復合材料等，它們都具有多孔的結構，對目標物有良好吸附性，多被用來作為固相萃取的填料[5-7]。Liang等[8-9]通過對小分子配體核苷酸和金屬離子間的反應研究，合成了超分子網狀結構金屬-有機凝膠。它是由AMP和Zn2+通過配位鍵自組裝的方式形成的，具有多孔結構，性能穩定，可以固定抗體。該材料在制備及偶聯抗體的過程中，無需特殊反應條件和試劑，制備簡單[5]。我們將其作為一種免疫基材與當前熱門的研究-納米磁珠技術[10-11]結合起來，制備出了一種新型的以AMP&ZnCl2水凝膠為基質的免疫磁珠[13-15]。

真菌毒素種類繁多，毒性大，有致癌、致畸、致突變作用，嚴重威脅人類的健康[16-18]。真菌毒素樣品前處理方法主要有固相(微) 萃取、液相(微) 萃取、免疫親和層析、磁分離技術等，這些前處理方式雖然都能實現對目標物的分離，但是相應的還有一定的缺點。如固相萃取法一般采用固相萃取柱進樣填料裝柱麻煩，選擇性也差；液相萃取的缺點是穩定性差，不能重復使用；免疫親和層析法雖然選擇性強，但是成本高、機械強度差；磁分離技術的選擇性差，需要用免疫材料輔助來提高其靈敏度[19]。

本研究就是基于磁分離技術操作簡單、機械強度大、穩定性好的優點[20]，選擇了一種制備起來較為簡單的免疫基材-AMP&ZnCl2·ZEA單抗，制備成免疫磁珠應用到糧谷制品中玉米赤霉烯酮毒素的前處理[21-22]。這種新型的以金屬有機框架材料為基質的免疫磁珠的制備為今后免疫磁珠的深入研究拓寬了思路，其在真菌毒素檢測中的應用擬為解決食品中真菌毒素的純化問題提供方法借鑒，也為新型的真菌毒素檢測材料的研究和開發提供了新的方向。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

ZEA單抗:北京點石科創科技有限公司和本課題組合作研發制備；甲醇、乙腈(色譜純):美國Fisher公司；七水合硫酸亞鐵、氫氧化鉀、硝酸鉀、體積分數為25% 戊二醛溶液、司班80、石蠟溶液、氯化鋅(分析純):汕頭市西隴化工廠有限公司；一磷酸腺苷二鈉鹽(色譜純):SIGMA公司；10 mmol/L pH 7.4 HEPES溶液:北京欣華綠源科技有限公司；0.01 mol/L pH 7.4 磷酸鹽緩沖液:HyClone公司；玉米粉:回龍觀城北市場；DZTMS-PREP免疫親和柱:德國 R-Biopharm。

1.2 儀器與設備

1200高效液相色譜-6410三重四級桿質譜聯用儀:美國安捷倫公司；DSHZ-300A 水浴恒溫振蕩器:蘇州培英實驗設備有限公司；Nicolet iS10傅里葉紅外光譜儀:美國賽默飛世尓科技分子光譜；S-4300場發射掃描電子顯微鏡:日本日立/Hitachi高新技術公司；HL-2恒流泵:上海滬西分析儀器廠有限公司；JJ-1精密增力電動攪拌器:常州國華電器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 Fe3O4@AMP&ZnCl2·ZEA單抗磁珠的制備1.3.1.1 Fe3O4磁核的制備[10]

稱取20.0 g七水合硫酸亞鐵溶解于140.0 mL去離子水中，水浴加熱到90 ℃并在轉速400 r/min的機械攪拌條件下反應1 h。同時另取1.6 g硝酸鉀和11.2 g氫氧化鉀溶解于60.0 mL去離子水中，配制好的溶液用恒流泵逐滴(1 mL/min)加入至亞鐵離子溶液中。添加完畢繼續在90 ℃下攪拌2 h，得黑色渾濁溶液，用去離子水洗滌數次并烘干，黑色固體即為四氧化三鐵。

1.3.1.2 AMP&ZnCl2水凝膠包覆磁珠[13]

稱取0.196 g 一磷酸腺苷二鈉鹽溶解于20 mL HEPES buffer(10 mmol/L，pH7.4)中，再加入200 mg 四氧化三鐵，充分攪拌。將150 mL含7%司班80的石蠟混合液在攪拌狀態下逐滴加入其中，經500r/min攪拌形成乳化體系，持續攪拌30 min水浴加熱至40 ℃，然后加3 mL戊二醛溶液(C5H8O2，體積分數25%)，恒溫交聯反應30 min。降低溫度，在常溫條件下將2 mL 1 mg/mL ZEA單抗用恒流泵逐滴(1 mL/min)加入反應體系中，攪拌均勻后再用恒流泵逐滴(1 mL/min)加入10 mL 50 mmol/L的ZnCl2溶液，常溫交聯反應2 h。

反應結束后，依次用石油醚、乙醇、去離子水洗滌數次，用磁鐵分離出固體物即獲得包覆了水凝膠并偶聯了ZEA單抗的磁性微球，將其封存于HEPES buffer(10 mmol/L，pH 7.4)中。

1.3.2 Fe3O4@AMP&ZnCl2·ZEA單抗磁珠的鑒定與評價

1.3.2.1 Fe3O4@AMP&ZnCl2·ZEA單抗磁珠的表征

用場發射高分辨掃描電子顯微鏡觀察Fe3O4微球和Fe3O4@AMP&ZnCl2·ZEA單抗磁珠形態；紅外光譜儀測定Fe3O4@AMP&ZnCl2·ZEA單抗磁珠表面官能團性質：稱取樣品1～2 mg，加入200 mg溴化鉀粉末研磨，壓片法測定其紅外光譜。

1.3.2.2 Fe3O4@AMP&ZnCl2·ZEA單抗磁珠的負載量及重復性使用效果

取100 mg Fe3O4@AMP&ZnCl2·ZEA單抗磁珠于10 mL離心管中，先用超純水洗滌兩遍，用磁鐵收集磁珠除去水洗液。加入3 mL 1.2 μg/mL的ZEN毒素標準溶液，混合均勻，在搖床上振蕩反應30 min。反應結束后，用磁鐵收集磁珠，取出上清液用孔徑為0.22 μm的有機相微濾膜過濾后，測定其中的ZEA濃度。根據上清液體積，計算上清液中ZEA質量。用3 mL超純水洗滌兩次磁珠，用磁鐵收集磁珠，合并兩次水洗液用孔徑為0.22 μm的有機相微濾膜過濾洗滌液，測定其中的ZEA濃度，由水洗液體積，計算水洗液中ZEA質量。用3 mL甲醇(3 mL/次)洗滌磁珠三次，每次加入甲醇后振搖10 min，洗脫磁珠上吸附的ZEA毒素，用磁鐵收集磁珠，取出甲醇洗脫液用孔徑為0.22 μm的有機相微濾膜過濾后，三次洗脫液不合并，分別測定甲醇洗脫液中ZEA濃度，根據每次的醇洗液體積，計算醇洗液中ZEA總質量。

ZEA負載量=添加的ZEA質量-上清液中ZEA質量-水洗液中ZEA質量

(1)

(2)

1.3.3 ZEA毒素檢測方法[23]

本實驗使用1200高效液相色譜-6410三重四級桿質譜聯用儀，來測定樣品中提取ZEA毒素含量。建立了ZEA液相色譜-串聯質譜法(LC-MS/MS)。

色譜條件：Agilent ZORBAX Bonus-RP色譜柱(50 mm×2.1 mm，3.5 μm)，柱溫 45 ℃，進樣量 50 μL；流動相為10 mM 乙酸銨水溶液 (A)和乙腈 (B)，梯度條件：0～0.1 min，B為10%；0.1～2 min，B由10%升到50%；2～10 min，B由50%升到80%；10～15 min，B為80%；15～16 min，B由80%降至10%；16～20 min，B保持10%。電離模式、監測離子對(m/z)和其他參數見表1

質譜條件：離子化模式采用電噴霧電離正離子模式(ESI+)和負離子模式(ESI-)；質譜掃描方式選擇多反應監測(MRM)；正離子模式(ESI+)噴霧電壓為4500 V；負離子模式(ESI-)噴霧電壓為2 500 V；離子源溫度 450 ℃；氣簾氣8 L/min。

表1 ZEA毒素的質譜參數

注：※.定量離子。

1.3.4 實際樣品的應用1.3.4.1 實際樣品中ZEA毒素的提取[21]

稱取玉米粉樣品25.0 g(精確至0.1 g)于500 mL具塞錐形瓶中,加入100 mL70%甲醇溶液(V/V)，浸泡15 min，超聲振蕩40 min，過濾得到樣品提取液A,取2 mL濾液用48mL PBS溶液稀釋，得到提取液B。

1.3.4.2 免疫親和柱對實際樣品的應用[21]

取16 mL 提取液B，以2 mL/min的速度過免疫親和柱，再用16 mL H2O以5 mL/min的速度洗滌柱子；用1 mL 100%甲醇溶液(V/V)以1 d/s的速度洗脫柱子，將洗脫液收集于2 mL的樣液瓶中，再用1 mL H2O以5 mL/min的速度洗滌免疫親和柱，同樣收集于上述樣液瓶中。用Agilent 1200-ESI 6410液相色譜-質譜聯用儀上機檢測，進樣量為50 μL。

1.3.4.3 Fe3O4@AMP&ZnCl2·ZEA單抗磁珠對實際樣品的應用

取100 mg Fe3O4@AMP&ZnCl2·ZEA單抗磁珠于50 mL離心管中，先用超純水洗滌兩次，用磁鐵收集磁珠除去水洗液。然后加入30 mL提取液B，振蕩反應30 min，用磁鐵收集磁珠去除上清液，加入20 mL超純水以10 mL/次洗滌磁珠兩遍。最后加入30 mL甲醇以10 mL/次洗滌3次，收集三次的醇洗液，用Agilent 1200-ESI 6410液相色譜-質譜聯用儀分別測定三次甲醇洗脫液中的ZEA毒素濃度，根據醇洗液體積，計算甲醇解吸液中的ZEA總質量。

2 結果與討論

2.1 Fe3O4@AMP&ZnCl2·ZEA單抗磁珠的鑒定

2.1.1 SEM表征

用場發射高分辨掃描電子顯微鏡進行觀察。圖1(a、c)所示的是Fe3O4微球的SEM圖片，Fe3O4磁核粒徑在100～300 nm 之間，磁核成球不穩定，有些磁核呈不規則狀。由于磁核性質較為活潑和外加磁場分離過程中導致的部分磁珠磁化，使得磁核易發生團聚，分散性不好。圖1(b、d)是Fe3O4@AMP&ZnCl2·ZEA單抗磁珠的SEM圖片，對比Fe3O4磁核的SEM圖片，可以看出不規則狀磁核的棱角被鈍化，圖1(b、d)中這些包覆后的磁核都趨于球形，磁核表面也由光滑變得粗糙。通過對比分析磁核包覆前后的SEM圖片，可以看出圖1(b、d)中磁核表面有包覆物存在。

圖1 Fe3O4微球(a、c)Fe3O4@AMP&ZnCl2·ZEA單抗磁珠(b、d)SEM表征圖

2.1.2 紅外光譜表征

圖2 Fe3O4@AMP&ZnCl2·ZEA單抗磁珠的紅外光譜圖

2.2 Fe3O4@AMP&ZnCl2·ZEA單抗磁珠的負載量及重復性使用的效果評價

按照1.3.4.3的方法對Fe3O4@AMP&ZnCl2·ZEA單抗磁珠重復使用3次，計算每次使用的負載量和回收率。結果見表2，發現每100 mg Fe3O4@AMP&ZnCl2·ZEA單抗磁珠的ZEA毒素負載量為3μg左右，隨著使用次數的增加，負載量逐漸下降。這是因為一方面洗脫劑甲醇會對抗體結構造成破壞，使得部分抗體活性降低甚至失活，部分抗原抗體結合能力減弱或消失；另一方面，由于部分ZEA毒素未能從抗體上洗脫掉，使得抗原抗體的部分結合位點被占據，導致毒素能夠結合抗體的位點減少，負載量下降。

通過對三次重復使用的效果分析，可以發現Fe3O4@AMP&ZnCl2·ZEA單抗磁珠對ZEA毒素有高效的吸附能力，毒素的解吸效果良好，可以實現較高回收率且具有可多次重復性使用的優點。

表2 Fe3O4@AMP&ZnCl2·ZEA單抗磁珠重復使用3次的吸附及洗脫情況

2.3 Fe3O4@AMP&ZnCl2·ZEA單抗磁珠添加回收率評價

按照1.3.4.1和1.3.4.3的方法，選擇c樣品玉米粉進行ZEA毒素的添加回收率實驗,添加回收率計算公式見(3)，添加水平分別為30、60、90 μg/kg，每個水平進行6次重復實驗。結果見表3，C樣品玉米粉3個水平的添加回收率在84.61%～90.00%之間，相對標準偏差為4.86%～9.44%，符合痕量分析的要求，說明制備的Fe3O4@AMP&ZnCl2·ZEA單抗磁珠能用于實際樣品的純化。

(3)

式中：P表示ZEA毒素的添加回收率，m2為25 g樣品添加標品后檢測到的ZEA毒素總質量，m1為25 g樣品本底ZEA毒素質量，m為25 g樣品中添加的ZEA毒素標品質量。

表3 Fe3O4@AMP&ZnCl2·ZEA單抗磁珠純化C樣品中ZEA毒素的添加回收率

2.4 DZTMS-PREP免疫親和柱和Fe3O4@AMP&ZnCl2·ZEA單抗磁珠的實際應用效果比較

按照1.3.4.1的方法分別對市面上6種玉米粉中ZEA毒素進行提取，然后分別采用1.3.4.2和1.3.4.3對6種樣品提取液中ZEA毒素進行純化，每組實驗重復3次，按照1.3.3方法進行檢測。結果見表4，通過Fe3O4@AMP&ZnCl2·ZEA單抗磁珠和DZTMS-PREP免疫親和柱兩種前處理方式分別對實際樣品進行純化，結果顯示采用兩種前處理方式檢測到的ZEA毒素在樣品中的分布規律是一致的，說明制備的ZEA單抗磁珠有較好的使用效果。

根據食品安全國家標準GB 2761—2017[24]規定，玉米粉中玉米赤霉烯酮ZEA的限量指標是60 μg/kg，所以6種樣品中b樣品ZEA含量超標。

表4 免疫親和柱和Fe3O4@AMP&ZnCl2·ZEA單抗磁珠兩種方法對6種玉米粉純化后ZEA毒素的檢測結果

注：x為平均值；y為標準偏差。

3 結論

本研究將金屬有機框架材料制備簡單、可以固定抗體的特性和Fe3O4納米磁珠便于收集的優勢結合起來，通過對磁珠包覆技術的研究，將偶聯了ZEA單抗的金屬有機框架材料AMP&ZnCl2成功包覆在Fe3O4納米磁珠表面，制備了一種新型的Fe3O4@AMP&ZnCl2·ZEA單抗磁珠。通過電鏡和紅外兩種表征方法對Fe3O4@AMP&ZnCl2·ZEA單抗磁珠的進行了鑒定。驗證并確定了制備的Fe3O4@AMP&ZnCl2·ZEA單抗磁珠的ZEA毒素負載量為3 μg/100 mg左右，隨著使用次數增加，負載量會有所下降。使用Fe3O4@AMP&ZnCl2·ZEA單抗磁珠對c樣品玉米粉進行了3個水平的添加回收率實驗，該樣品的添加回收率在84.61%～90.00%之間，相對標準偏差為4.86%～9.44%，符合痕量分析的要求。最后選擇了6種玉米粉，與免疫親和柱的純化效果進行比較，從結果可以看出Fe3O4@AMP&ZnCl2·ZEA單抗磁珠對樣品的純化效果和免疫親和柱的純化效果基本相同。因此，Fe3O4@AMP&ZnCl2·ZEA單抗磁珠的制備是成功的，且具有良好的使用效果，可以應用于實際樣品的純化。