氯化鈣與1-甲基環丙烯對伽師瓜果實軟化與果膠酶活性及其基因表達影響

張強，代文婷，金新文*

1(新疆大學 生命科學與技術學院，新疆 烏魯木齊，830046)2(新疆農墾科學院農產品加工研究所，新疆 石河子，832000)

伽師瓜是厚皮甜瓜(Cucumismelo)的代表性品種，主要產于中國西部地區，其形體勻稱飽滿、肉厚質細、香甜清脆、含糖量高、風味獨特，居新疆甜瓜之首。但伽師瓜采后易發生后熟與軟化，貯藏時間短，因此，延緩果實的后熟與軟化，對伽師瓜長期貯藏、遠運銷售、保持良好的食用口感與商品性均有積極的作用。

伽師瓜屬于呼吸躍變型果實，其特點為果實從生長停止到開始進入衰老期間，呼吸速率與乙烯釋放量出現躍變現象，果實迅速后熟并軟化[1]。軟化過程中，原果膠水解為可溶性果膠，使果膠與纖維素和半纖維素的整體結構發生解聚而變松散，表現為果實變軟和水化[2-3]。推遲或抑制呼吸躍變，減少乙烯釋放量，是延緩果實衰老軟化的有效措施。

1-氨基環丙烷基羧酸(ACC)氧化酶(ACO)催化ACC轉化生成乙烯，是果實內源乙烯產生的主要途徑，鈣能夠抑制ACC合成酶(ACS)活性，使含量處于低水平，同時能抑制ACC氧化酶(ACO)的活性，從而抑制內源乙烯的產生，用鈣處理網紋甜瓜，能夠降低果實呼吸強度和乙烯釋放量[4]。同時，鈣是細壁結構的必要物質，CHARDONNET[5]通過鈣滲透“金冠”蘋果皮質組織，能有效抑制細胞壁組分變化，維持果實的硬度。鄧佳等[6]用鈣處理葡萄柚果實，細胞壁降解酶活性變化及其相關基因表達量均有所降低，并能有效維持果實的硬度。乙烯對果實具有催熟作用，果實后熟過程又產生大量乙烯[7]，1-甲基環丙烯(1-methylcyclopropene,1-MCP)是一種乙烯作用的抑制劑，能競爭性與乙烯受體結合，阻斷乙烯信號傳導，抑制乙烯的后熟作用[8]。郭子娟用1-MCP處理亞特獼猴桃，呼吸速率與乙烯釋放量均顯著降低[9]。馬文平用1-MCP處理玉金香甜瓜，有效抑制了裂解細胞壁主要酶的活性，延緩了果實的軟化[10]。目前，將鈣與1-MCP聯合使用對伽師瓜采后貯藏期間果實生理代謝方面的研究鮮有報道。因此，本文以甜瓜厚皮品種伽師瓜為材料，研究CaCl2與1-MCP對伽師瓜在貯藏過程中呼吸作用、乙烯釋放量、果實硬度與質構特性、果膠水解酶(多聚半乳糖醛酸酶PG、果膠甲酯酶PME和果膠裂解酶PL)活性及酶基因表達量的影響，為延緩伽師瓜采后果實軟化、提高其商品性提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

CaCl2(分析純)，購于天津市鼎盛鑫化工有限公司；1-甲基環丙烯，購于青島綠諾生物科技有限公司；厚皮甜瓜伽師品種，由新疆大學生物工程研究中心提供。RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒(DP441)，Quant One Step RT-PCR kit(KR113)反轉錄酶，lnRcute lncRNA cDNA第一鏈合成試劑盒(去基因組) (KR202)，Talent熒光定量檢測試劑盒(SYBR Green)FP209，天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 儀器與設備

3051H型呼吸強度測定儀，杭州綠博儀器有限公司；AGY-1型果實硬度測量計，溫州艾力儀器制造有限公司；TEX-100N質構儀，日本JISC公司；Trace GC 1300氣相色譜儀，賽默飛世爾科技公司；Line Gene 9600 Plus熒光定量PCR儀，杭州博日科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 對伽師瓜果實進行CaCl2與1-MCP處理濃度篩選

選取達到商品成熟度、無外傷、重量、果型一致的果實，在果實采摘后8 h內完成以下處理：

CaCl2處理：分別用質量分數為0.5%、1%、2%、4%的CaCl2溶液浸泡5 min，通風室溫晾干[11]；

1-MCP處理：分別用0.25、0.5、1、2 μL/L的1-MCP在20 ℃下熏蒸24 h[12]；

處理之后分別進行CaCl2與1-MCP最佳處理濃度篩選實驗。

1.3.2 樣本處理

選取成熟度、重量、大小、果型一致，沒有統計學差異的無外傷果實400個作為樣本池，對照組與3個處理組各從樣本池中隨機抽取100果實做實驗樣本，對照組不做處理，直接貯藏(樣本處理與貯藏在果實采摘后8 h內完成)；

CaCl2與1-MCP處理分別用篩選的最優濃度處理果實樣本；

CaCl2與1-MCP聯合處理：根據CaCl2與1-MCP處理濃度篩選結果，先用最優濃度CaCl2處理，再用最優濃度1-MCP處理，處理后單果套泡沫網袋后裝入包裝箱，10 個/箱；

對照組與處理組樣本均置于溫度(20±1) ℃，濕度(50±5)%的保鮮庫中貯藏。

1.3.3 呼吸強度與乙烯釋放量的測定

果實呼吸強度用氣流法測定[13]，每次取9個果實，分3組，每組3個果實，放入呼吸強度測定儀(氣流速度0.4 L/min)進行測定，每組重復測3次，單位:CO2mg/(kg·h)。

乙烯釋放量的測定：參照LI等[14]的方法，用氣相色譜儀進行測定，每次取9個果實，分3組，每組3個果實進行測定，每組重復測3次。

(1)

式中:C,待測樣品釋放的乙烯含量,μL/L；V，干燥器的體積與待測樣品體積之差值,mL；m,待測樣品質量,kg；t,密閉時間,h。

1.3.4 果實硬度與果肉質構特性的測定

參照CAMPS與李明霞等[15-16]的方法，每次處理用9個果實，使用果實硬度計測定，重復3次，單位：kg/cm2。

果肉剪切形變時間與抵抗力的測定[17-18]：將果肉切為1.5 cm3正方形塊狀，置于測試夾具中，探頭速率為100 mm/min，測試壓縮程度設定為30 mm，觸發值設定為0.049 N，每個處理用果實9個，在每個果實胴部不同部位對稱均取4個位點果肉測定，重復3次。

1.3.5 原果膠與可溶性果膠含量測定

參照紀淑娟等[19]的方法，單位分別以每克鮮重中可溶性果膠和原果膠的毫克數表示，即mg/g FW。

1.3.6 果膠酶活性的測定

多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase, PG)活性的測定：參照FIGUEROA與劉耀娜的方法[20-21]。以每分鐘每克鮮樣在37 ℃分解多聚半乳糖醛酸產生1 μmol的半乳糖醛酸的質量表示，即μg/(g·min)。

果膠甲酯酶(pectin methylesterase, PME)活性的測定[21-22]：用NaOH滴定法測定酶活性，以該條件下每分鐘每克鮮樣催化果膠釋放1 mmol的CH3O-為一個酶活性單位，即mmolCH3O-/(g·min)。

果膠酸裂解酶(pectate lyase, PL)活性的測定：參考ANURAG等[23]的方法，以每克鮮質量每分鐘在波長235 nm處吸光度值(OD235)的變化表示，即ΔOD235/(g·min)。

1.3.7 果實PG、PME和PL基因的定量表達分析[24-25]

果實總RNA提?。喝?00 mg果肉在液氮中迅速研磨成粉末，用RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取總RNA；

cDNA鏈合成：將提取的RNA用逆轉錄酶與反轉錄試劑盒合成cDNA第一鏈；

實時熒光定量PCR(quantitative Real- time PCR, qRT-PCR)分析：以Actin作為內參基因，用premier 5.0軟件設計酶基因的qPCR引物如表1所示，以合成的cDNA，用熒光定量PCR儀與熒光定量檢測試劑盒進行實時熒光定量PCR分析。

表1 實時定量PCR所需引物Table 1 Primers for qRT-PCR analysis

1.4 數據處理

實驗數據采用Excel統計和繪圖，用SPSS 17.0軟件系統進行方差分析，以P<0.05作為差異顯著的標準。

2 結果與分析

2.1 對樣本進行CaCl2與1-MCP處理濃度的篩選

2.1.1 不同濃度的CaCl2處理對伽師瓜貯藏過程中呼吸強度與乙烯釋放量的影響

分別用0.5%、1%、2%、4%質量分數的CaCl2處理伽師瓜，如圖1-A、圖1-B所示。4個濃度CaCl2處理樣本果實的呼吸強度與乙烯釋放量均較對照組低(P<0.05)，并且對照組呼吸強度與乙烯釋放量有明顯的躍變現象，均在第8天出現躍變峰，處理組也出現類似的躍變峰，但躍變幅度較小，且躍變時間有所延遲，0.5%、4%的CaCl2處理樣本在第10天出現躍變峰，1%、2%的CaCl2處理樣本在第12天出現躍變峰，其中，2%的CaCl2處理樣本呼吸強度與乙烯釋放量最低，躍變峰值也最小。此外，依次用0.5%、1%、2%的CaCl2處理樣本對呼吸強度與乙烯釋放量的抑制作用逐漸增強，而4%的CaCl2處理樣本，則抑制作用減弱。因此，選擇2%的CaCl2處理樣本較為適宜。

2.1.2 不同濃度的1-MCP處理對伽師瓜貯藏過程中呼吸強度與乙烯釋放量的影響

由圖2-A、圖2-B可知，4個濃度的1-MCP處理果實均有降低呼吸強度與乙烯釋放量的作用，并且隨濃度升高，抑制作用增強，但處理濃度超過1 μL/L后，則變化不顯著。

圖1 不同濃度CaCl2處理對伽師瓜采后貯藏過程中呼吸強度(A)與乙烯釋放量(B)的變化影響Fig.1 Effect ofCaCl2 treatment with different concentration on respiratory rate (A) and ethylene production (B) of Jiashi melon fruit during storage

圖2 不同濃度1-MCP處理對伽師瓜采后貯藏過程中呼吸強度(A)與乙烯釋放量(B)的變化影響Fig.2 Effect of 1-MCP treatment with different concentration on respiratory rate (A) and ethylene production (B) of Jiashi melon fruit during storage

0.25與0.5 μL/L的1-MCP處理組分別在第12天與14天出現躍變峰，0.5 μL/L組較0.25 μL/L組呼吸強度與乙烯釋放量低，且躍變峰值較小(P<0.05)；1 μL/L處理組與2 μL/L處理組的呼吸強度與乙烯釋放量均無顯著差異(P>0.05)，且沒有出現躍變現象。因此，從節約使用成本與減少藥害方面考慮，用1 μL/L的1-MCP處理樣本較為適宜。

根據以上實驗結果，后續實驗的CaCl2使用2%(質量分數)，1-MCP使用濃度為1 μL/L。

2.2 伽師瓜采后貯藏過程中呼吸強度與乙烯釋放量的變化

由圖3-A與圖3-B可知，處理組樣本呼吸強度與乙烯釋放量較對照組低(P<0.05)。對照組果實呼吸強度與乙烯釋放量有躍變現象，貯藏初期變化緩慢，在第6天至第8天，CO2由73.9 mg/(kg·h)迅速增至231 mg/(kg·h)，乙烯釋放量由10.9 μL/(kg·h)增至25.5 μL/(kg·h)；在處理組中，CaCl2處理組在第12天出現類似躍變現象，但變化幅度較對照組小(P<0.05)，1-MCP處理組較CaCl2組低，未出現躍變現象。CaCl2與1-MCP結合使用呼吸強度與乙烯釋放量最低，變化較為平緩，且沒有躍變現象。

圖3 CaCl2與1-MCP處理對伽師瓜采后貯藏過程中呼吸強度(A)與乙烯釋放量(B)的變化影響Fig.3 Effect of CaCl2 and 1-MCP treatment on respiratory rate (A) and ethylene production (B) of Jiashi melon fruit during storage

2.3 伽師瓜貯藏過程中果實硬度與果肉質構性能變化

2.3.1 果實硬度的變化

由圖4所示，隨著貯藏時間的延長，對照組與處理組果肉的硬度均不斷下降。

圖4 CaCl2與1-MCP處理對伽師瓜采后貯藏過程中果實硬度變化影響Fig.4 Effect of CaCl2 and 1-MCP treatment on firmness of Jiashi melon fruit during storage

對照組果肉硬度下降較處理組快(P<0.05)，由第2天的13.9 kg/cm2下降至第18天的6.7 kg/cm2，并且在第8天至第10天呈加速下降，由11.6 kg/cm2下降至9.1 kg/cm2，之后下降速度緩慢。在處理組中，3種處理方式果肉硬度變化存在差異，CaCl2組下降速度最快，1-MCP組次之，CaCl2與1-MCP聯合使用下降最慢(P<0.05)，從第2天至第18天，CaCl2組果肉硬度由14.3 kg/cm2下降至8.7 kg/cm2，1-MCP組由14.9 kg/cm2下降至10.5 kg/cm2，CaCl2與1-MCP聯合使用組由14.5 kg/cm2下降至10.8 kg/cm2。

2.3.2 伽師瓜貯藏過程中果肉剪切形變時間與抵抗力的測定

果肉質構是衡量伽師瓜食用價值與商品性的重要指標。甜瓜果肉質構特性常用最大抵抗力與剪切變形時間為參考[17]，結果由表2可知，伽師瓜在貯藏過程中，隨著保鮮時間的延長，對照組與處理組樣本果肉的最大抵抗力均不斷下降，果肉剪切形變發生時間也不斷縮短。在貯藏第2天，對照組果肉最大抵抗力與剪切形變發生時間分別為139.6 N，21.3 s，第18天分別為67.4 N，2.3 s，下降速度顯著高于處理組(P<0.05)。

表2 CaCl2與1-MCP處理對伽師瓜貯藏期間果肉剪切形變時間與抵抗力變化影響Table 2 Effects of CaCl2 and 1-MCP treatment on shear deformation time and resistance of Jiashi Melon during storage

在前12天，CaCl2組樣本果肉的最大抵抗力與剪切形變發生時間的下降速度較1-MCP組慢，之后CaCl2組較1-MCP組下降速度快(P<0.05)，這是由于鈣是乙烯抑制劑，也是構成細胞壁的元素，外源鈣對維持果肉的質構特性有積極作用，但鈣不能完全抑制躍變現象，因此，CaCl2組果實代謝發生躍變后質構性能加速下降。CaCl2與1-MCP聯用組下降速度較單獨處理實驗組低，并且與對照組差異更為顯著(P<0.05)，在第18天時CaCl2組果肉最大抵抗力與剪切形變發生時間分別為85.2 N，9.1 s，相應的，1-MCP組分別為95.9 N，11.6 s，CaCl2與1-MCP 聯用組分別為99.7 N，12.9 s。

2.4 伽師瓜貯藏過程中果膠含量變化

圖5-A與圖5-B顯示，在貯藏過程中，對照組與處理組原果膠含量均不斷下降，可溶性果膠含量則呈不斷上升。

圖5 CaCl2與1-MCP處理對伽師瓜貯藏過程中原果膠(A)與可溶性果膠(B)含量變化的影響Fig.5 Effect of CaCl2 and 1-MCP treatment on propectin content (A) and soluble pectin content (B) of Jiashi melon fruit during storage

對照組原果膠含量由第2天的18.5 mg/g下降至第18天的7.7 mg/g，并在第6天至10天快速下降，可溶性果膠由第2天的5.2 mg/g上升至第18天的16.3 mg/g，第6天至10天快速上升，之后變化較為緩慢；處理組中，3種處理方法，原果膠含量下降速度與可溶性果膠含量上升速度均較對照組慢(P<0.05)， 其中CaCl2組與1-MCP組變化差異較小，且均有小幅波動。CaCl2與1-MCP聯合使用，原果膠含量與可溶性果膠含量變化最緩慢，從第2天至第18天，原果膠含量由19.9 mg/g下降至13.6 mg/g，可溶性果膠由4.1 mg/g上升至8.5 mg/g，并且變化較穩定。

2.5 果膠水解酶活性及相關酶基因表達量的變化

2.5.1 PG酶活性與酶基因表達量的變化

由圖6-A與圖6-B可知，在貯藏過程中，對照組樣本PG活性與酶基因表達量均較處理組高(P<0.05)，且對照組酶活性與酶基因表達量均存躍變現象。

圖6 CaCl2與1-MCP處理對伽師瓜貯藏過程中PG酶活性(A)PG酶基因表達量(B)變化的影響Fig.6 Effect of CaCl2 and 1-MCP treatment on enzyme activity of PG (A) and CmPG gene expression (B) of Jiashi melon fruit during storage

在處理組中，CaCl2組在貯藏第12天出現小幅度的躍變峰，其他處理方式未出現躍變現象，此外，對照組與處理組樣本酶活性與酶基因表達量增減均表現出同步性。

2.5.2 PME酶活性與酶基因表達量的變化

由圖7-A與圖7-B可知，在貯藏初始期，對照組與處理組PME活性無顯著差異(P>0.05)，隨后對照組PME活性出現躍變現象，在第6天達到峰值，之后迅速下降，在第12 天至14 天時下降至處理組水平，在第16天至18天，低于處理組；在處理組中，3種處理方法樣本PME活性變化均較對照組緩慢(P<0.05)，且均呈不斷下降趨勢，整體上看，3種處理方法之間PME活性沒有顯著差異，但變化過程中，CaCl2組變化波動較大，1-MCP組次之，CaCl2與1-MCP 聯合使用下降最為平緩。

2.5.3 PL酶活性與酶基因表達量的變化

如圖8-A與圖8-B所示，在初始期，對照組PL活性與酶基因表達水平均高于處理組，并存在躍變情況，在第8天達到峰值，從第14天開始，低于處理組；處理組PL活性與酶基因表達水平變化較對照組緩慢，CaCl2組在貯藏初期至中期高于1-MCP組和聯合處理組，貯藏后期，則差異不顯著，1-MCP組和聯合處理組之間差異不顯著(P>0.05)。

圖8 CaCl2與1-MCP處理對伽師瓜貯藏過程中PL酶活性(A)PL酶基因表達量(B)變化的影響Fig.8 Effect of CaCl2 and 1-MCP treatment on enzyme activity of PL (A) and CmPL gene expression (B) of Jiashi melon fruit during storage

3 討論

乙烯是果實后熟軟化的誘導因素，乙烯能促使呼吸代謝強度增加，上調果膠酶基因的表達，產生果膠水解酶，使原果膠水解導致細胞壁結構改變，表現為果實發生后熟與軟化[26]。本實驗結果顯示，對照組與處理組樣本的呼吸強度、果膠酶活性及酶基因表達水平均與乙烯釋放量呈正向協同效應。

鈣是構成細胞壁的重要元素，有拮抗乙烯催熟與抑制細胞壁物質水解酶活性的作用，能夠延緩果實軟化[27]。用不同濃度的CaCl2處理樣本，果實的呼吸強度、乙烯釋放量均有所降低，并且躍變期有所推遲，躍變峰值也顯著降低。增加外源鈣，有助于抑制果實的后熟、維持細胞壁結構的穩定，李天來等[28]用硝酸鈣處理網紋甜瓜，結果顯示，5 mmol /L的硝酸鈣較1、3 mmol/ L的硝酸鈣對乙烯釋放量與呼吸強度有更強的抑制作用。鈣具備抑制后熟與維持細胞壁結構穩定作用的同時，也是細胞信號重要的傳導物質，過多的增加鈣又會促進果實后熟生理代謝中信號的傳導，本研究結果顯示，用2%的CaCl2處理伽師瓜，較0.5%與1%處理濃度對果實后熟的抑制作用強，但用4%的CaCl2處理果實，對后熟的抑制作用反而減弱。1-MCP能夠阻斷乙烯與受體的正常結合，從而抑制乙烯的催熟作用，并能減少由后熟所導致的乙烯進一步釋放。在本實驗中，用0.25、0.5、1、2 μL/L的1-MCP處理樣本均能降低果實呼吸強度與乙烯釋放量，其中用1、2 μL/L的1-MCP處理樣本，果實沒有出現躍變現象，馬文平等[10]用1-MCP處理甜瓜也得到類似結果。但用1、2 μL/L的1-MCP處理樣本，果實呼吸強度與乙烯釋放量均無顯著差異，由此可知，1-MCP對乙烯受體的競爭結合存在飽和性，超過飽和值，并不能進一步增強抑制作用。將CaCl2與1-MCP聯合使用，即鈣能拮抗乙烯的催熟作用，1-MCP能夠阻斷殘留乙烯的信號傳導，使兩種抑制后熟的作用機制形成互補。在本實驗中，用2%的CaCl2與1 μL/L的1-MCP 聯合處理樣本，對果實呼吸作用與乙烯釋放的抑制作用較單獨使用時更強，且更穩定。

原果膠水解成為可溶性果膠，是果實發生軟化的重要因素[29]。劉耀娜等[21]對厚皮甜瓜果實后熟軟化研究顯示，甜瓜果實在軟化過程中，原果膠含量不斷降低，可溶性果膠含量逐漸上升，而纖維素含量則變化較小[30]。本文參考前人研究，選擇果膠為切入點，對果膠含量變化、果膠酶活性與酶基因表達量進行檢測。結果顯示，在貯藏過程中，對照組與處理組中原果膠含量均逐漸降低，而可溶性果膠含量則均不斷上升。在本研究中，對照組果實硬度在第6天至第8天快速下降，這一時期原果膠水解產生可溶性果膠的速度也較快，與WEI等[31]的研究結果類似。

對照組中，PG、PME、PL活性與酶基因表達量均有躍變現象，PG、PL在貯藏第8天出現峰值，且與呼吸強度與乙烯釋放量的峰值時間一致，PME峰值出現在第6天，BRUMMELL認為貯藏前期PME首先啟動果膠降解，為其他降解酶如PG等提供底物[32]，這可能是PME活性與酶基因表達量峰值出現較早的原因。對照組PG活性與酶基因表達水平始終高于處理組，而PME和PL則分別在在第14天與第16天后低于處理組。在處理組中，CaCl2組PG活性與酶基因表達量存在小幅度的躍變情況，在第12天出現峰值，1-MCP與聯合處理組沒有出現躍變現象。結合樣本果膠含量與硬度變化分析可知，酶活性與酶基因表達量發生躍變對原果膠水解與果實硬度下降起至關重要的作用，平穩緩慢的變化則影響較小。

此外，在貯藏初始期，對照組果膠酶活性及其酶基因表達量均高于處理組，說明在用CaCl2與1-MCP處理樣本的過程中已對果實的后熟生理代謝產生了影響。

4 結論

CaCl2與1-MCP均能降低伽師瓜貯藏過程中呼吸強度、乙烯釋放量，并能有效抑制躍變現象，推遲甜瓜的后熟，同時能夠使果膠水解酶活性及酶基因表達量降低，延緩果實的軟化；將2%的CaCl2與1 μL/L的1-MCP聯合使用，對果實后熟的抑制作用較單獨使用時更強，且更穩定，能更好地延緩果實軟化。