豌豆低聚肽硒螯合物的穩定性研究

秦修遠，劉文穎，張靜波，朱少新，魯軍，谷瑞增，蔡木易*，張春樂*

1(中國食品發酵工業研究院有限公司，北京市蛋白功能肽工程技術研究中心，北京,100015)2(廣東中食營科生物科技有限公司，廣東 東莞,523122)

硒作為人體必須從外界攝入的微量元素之一，對于維持人的生命活動發揮著重要的作用。已有研究表明缺硒會導致人免疫力低下[1]。上世紀60年代，人們發現克山病的產生與缺硒有關[2]。目前常用的動物補硒方法有口服亞硒酸鈉，或在飼料中添加富硒酵母等[3-5]。但研究表明，有機態的硒比無機態的硒毒性更小，并且對于機體來說有更高的吸收率[5]。

豌豆低聚肽是豌豆蛋白酶解后得到的小分子肽物質。過去的代謝模型指出，生物機體不能夠直接吸收和利用蛋白質大分子。只有經過水解后得到氨基酸小分子才能在體內發揮作用。但近年來研究表明，動物對蛋白質的需要也依賴于一定數量的小分子活性小肽[6]。已有報道指出豌豆低聚肽具有抗菌[7]、抗氧化[8]、ACE抑制[9]等活性，是一種常見的生物活性肽。

豌豆低聚肽硒螯合物是一種將無機硒轉化為有機硒的新型補硒制品。已有前人研制出大豆肽硒螯合物[10]、靈芝肽硒螯合物[11]、魚頭蛋白肽硒螯合物[12]。但有關豌豆低聚肽與硒螯合卻鮮有報道。本文以分子質量分布和硒含量為指標，探究豌豆低聚肽硒螯合物對溫度、pH和消化方式的穩定性，為最終其在保健品市場中的應用提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 材料

豌豆低聚肽，廣東中食營科生物科技有限公司(1407WDSC001)；五水亞硒酸鈉(分析純)，天津市大茂化學試劑廠；3′3-二氨基聯苯胺(DAB 4HCl)(試劑級)、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)(生物技術級)、Biotopped Amresco；氫溴酸(分析純)，天津市福晨化學試劑廠；其他常規試劑(分析純)，北京化工廠；胃蛋白酶、胰蛋白酶，南寧龐博生物有限公司；三氟乙酸(分析純)，Alfa Aesar公司；乙腈(色譜純)，Fisher公司；透析袋(截留分子質量8 000～14 000 u)，Biotopped；超純水，實驗室自制。

1.1.2 儀器

EL20 pH計，Mettler Toledo；KQ-250E超聲波振蕩器，昆山市超聲儀器有限公司；1204007恒溫水浴鍋，蘇州珀西瓦爾實驗設備有限公司；酶標儀，Dynex Spectra Mr；DHG-9075A電熱恒溫鼓風干燥箱，北京陸?？萍加邢薰荆蝗f用電爐，北京科偉永興儀器有限公司；LC-20AD型高效液相色譜儀，日本島津公司；F30200150 凱氏定氮儀，Velp Scientifica公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 豌豆低聚肽硒螯合物的制備

取5 g豌豆低聚肽溶于100 mL超純水中，制備成5%的豌豆低聚肽水溶液。加入2.5 g五水亞硒酸鈉，于超聲波振蕩器中充分混合片刻。調節pH為9.0，在恒溫水浴80 ℃條件下螯合30 min。趁熱迅速倒入約4倍體積的95%乙醇。封口后靜置過夜。將上清液倒出，于35 ℃恒溫鼓風干燥箱中烘干，得到豌豆低聚肽硒螯合物樣品。

1.2.2 豌豆低聚肽硒螯合物得率和螯合率計算公式

(1)

其中：m1，螯合物中硒元素的質量；m2，加入螯合體系硒元素的質量。

(2)

其中：m3，螯合產物質量；m4，加入螯合體系總物質的質量。

1.2.3 豌豆低聚肽硒螯合物的分子質量分布測定

采用高效凝膠過濾色譜法測定樣品分子質量。選用乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸(分子質量為189 Da)、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸(分子質量為451 Da)、桿菌酶(分子質量為1 450 Da)、抑肽酶(分子質量為6 500 Da)、細胞色素C(分子質量為12 500 Da)5種肽標準品分別配制濃度為0. 1%溶液，選用聚四氟乙烯(孔徑為0.2 μm)過濾膜，將樣品過濾后再進樣。經高效凝膠色譜過濾后可繪制相對分子質量校正曲線。

流動相體積比為V(乙腈)∶V(水)∶V(三氟乙酸)=45∶55∶0.1，進樣體積: 10 μL;流速: 0.5 mL /min;柱溫度：20 ℃，檢測波長: 220 nm。利用紫外檢測器和GPC軟件進行采集和處理數據。將樣品測得的數據代入相對分子質量校正曲線方程中可得到樣品的肽分子質量和分布情況。用峰面積歸一化法可計算得不同分子質量范圍肽的相對百分比。

1.2.4 豌豆低聚肽硒螯合物指標的測定

配制1μg/mL的硒標準溶液，精確量取0.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL硒標準溶液，以超純水加至10 mL。加10 mL混酸(V(硝酸)∶V(高氯酸)=4∶1)電加熱爐上消解至澄清淡黃色狀態。添加5 mL 1∶1鹽酸，電加熱爐上繼續消解至1 mL。后加入10 mL EDTA-2Na溶液，10 mL 10%鹽酸羥胺溶液，混合后以1∶1鹽酸調節pH值為2～3。然后加入質量濃度為0.5%的DAB溶液，遮光靜置30 min。以40%NaOH調節溶液pH至6.8～7.0，以10 mL甲苯萃取反應產物。取有機層溶液，在420 nm處檢測吸光值。以硒濃度為橫坐標，以吸光值為縱坐標，繪制硒標準曲線。

將經過不同的溫度、pH值和消化方式處理后的豌豆低聚肽硒螯合物分別取3 mL轉移至透析袋。經60 h透析后，采用上述方法進行消解和檢測吸光度，對應標準曲線，確定樣品硒含量。

1.2.5 豌豆低聚肽硒螯合基礎物理化性質的測定

參照國標法GB 5009.3—2010，測定豌豆低聚肽硒螯合物的水分含量。參照國標法GB 5009.5—2010 測定豌豆低聚肽硒螯合物的總氮(蛋白質)含量。參照國標法GB 22729—2008，測定豌豆低聚肽硒螯合物中酸溶蛋白的含量。

1.2.6 熱穩定性實驗

將豌豆低聚肽硒螯合物樣品溶于超純水，配制成濃度為3 mg/mL的溶液，取20 mL溶液置于離心管中，分別在25、40、60、80、100 ℃下恒溫水浴2 h，其中25 ℃為室溫對照組。后冷卻至室溫，檢測其分子質量分布，經透析60 h后檢測硒含量。

1.2.7 酸堿穩定性實驗

將豌豆低聚肽硒螯合物樣品溶于超純水，配制成濃度為3 mg /mL的溶液，取20 mL溶液置于離心管中，分別用1 mol /L HCl和1 mol /L NaOH調節各管pH至3、5、7、9，11于37 ℃恒溫水浴鍋中放置2 h，同時設置一未處理的對照組，后冷卻至室溫，檢測其分子質量分布，經透析60 h后檢測硒含量。

1.2.8 體外模擬胃腸消化道實驗

1.2.8.1 胃蛋白酶消化實驗

將豌豆低聚肽硒螯合物樣品溶于超純水，配制成濃度為3 mg/mL的溶液，取30 mL溶液置于離心管中。以1 mol/L HCl調節溶液pH=2.0，在37℃恒溫水浴中孵育20 min。后添加0.6%(物料比，質量分數)的胃蛋白酶，充分混勻，迅速取出其中15 mL于沸水浴中處理20 min以終止酶解反應，作為消化前對照。剩余部分置于37 ℃恒溫水浴中處理4 h，然后于沸水浴中處理20 min以終止酶解反應。室溫下冷卻后檢測其分子質量分布，透析60 h后檢測硒含量。

1.2.8.2 胰蛋白酶消化實驗

將豌豆低聚肽硒螯合物樣品溶于超純水，配制成濃度為3 mg/mL的溶液，取30mL溶液置于離心管中。以10% NaOH調節溶液pH=7.5，在37 ℃恒溫水浴中孵育20 min。添加0.2%(物料比，質量分數)的胰蛋白酶，充分混勻，迅速取出其中15 mL于沸水浴中處理20 min以終止酶解反應，作為消化前對照。剩余部分置于37 ℃恒溫水浴中處理6 h，然后于沸水浴中處理20 min以終止酶解反應。室溫下冷卻后檢測其分子質量分布，透析60 h后檢測硒含量。

1.2.8.3 先胃蛋白酶消化實驗再胰蛋白酶消化實驗

按照1. 2. 7. 1的方法進行胃蛋白酶消化后，用10% NaOH調節pH為7.5，在37 ℃恒溫水浴鍋中孵育20 min，加入0.2%(物料比，質量分數)胰蛋白酶，充分混勻，迅速取出其中15 mL于沸水浴中處理20 min以終止酶解反應，作為消化前對照。剩余部分置于37 ℃恒溫水浴中處理6 h，然后于沸水浴中處理20 min以終止酶解反應。室溫下冷卻后檢測其分子質量分布，透析60 h后檢測硒含量。

1.2.9 統計學處理

采用SPSS v20 軟件對實驗數據進行統計學處理，數據結果采用單因素方差分析，若t檢驗，P<0.05，則證明有顯著性差異。

2 結果與討論

2.1 豌豆低聚肽的基礎理化成分

豌豆低聚肽中總蛋白含量為88.30%，酸溶蛋白含量為84.20%，水分含量4.46%，灰分含量5.04%，游離氨基酸含量(以干基計)2.93%，水解氨基酸含量66.82%，肽含量(以干基計)81.27%。

2.2 豌豆低聚肽螯合硒產物指標和理化性質

豌豆低聚肽硒螯合物的產物螯合率為(57.23±0.36)%，得率為(27.87±0.26)%，與相似工藝的肽硒螯合物[12]相比，具有更高的硒螯合率。已有大量文獻[13-14]指出，肽與某些元素螯合時，主要微量元素的離子形式與多肽中NH2+以及—COO—形成配位鍵，也存在少部分的物理附著。也有文獻[12]具體指出肽硒螯合物的螯合機制為Se4+與—NH2配合，羧基以共價鍵方式也與Se形成配合。推測豌豆低聚肽硒螯合物中，由Se4+提供4d空軌道，N、O能夠提供孤對電子，可分別占據空軌道形成配位鍵。

經檢測，豌豆低聚肽硒螯合物的酸溶蛋白含量為(23.22±0.12)%，總氮含量為(23.87±0.30)%，酸溶蛋白占粗蛋白的97.28%。說明豌豆低聚肽硒螯合物中的蛋白分子質量都較低。而較低分子質量的蛋白則更利于人體吸收。

水分活度對于食品的儲藏具有參考價值。經檢測，豌豆低聚肽硒螯合物的水分含量為(14.17±1.12)%。此水分含量相當于含水15%～17%的小麥粉，相應的aw值是0.80～0.87，文獻指出，在此范圍內，大多數霉菌和葡萄球菌都可被抑制[15]。

經檢測，豌豆低聚肽硒螯合物分子質量分布如表1所示。有超過76%的分子質量分布在1000 u以下，含量最高的是小于500 u的小肽，約占58.87%，此類小肽更易于在生物體內發揮作用[16]。

表1 豌豆低聚肽硒螯合物分子質量分布Table 1 Molecular weight distribution of selenium-chelating pea oligopeptide

2.3 豌豆低聚肽硒螯合物的熱穩定性

豌豆低聚肽硒螯合物經過40、60、80、100 ℃處理2 h后，觀察其水溶性、溶液顏色基本維持不變，經檢測其分子質量分布如表2所示。分子質量在1 000 Da之下的部分所占比例都在93%左右波動，大于1 000 Da的分子質量所占比例變化低于2%。整體上看，溫度的影響使得140～1 000 Da的比例增加。不同溫度處理后，豌豆低聚肽硒螯合物硒含量如圖1所示。與對照相比，豌豆低聚肽硒螯合物的硒含量無顯著性差異(a=0.05)。說明經過不同溫度處理后，螯合物的硒含量無變化，豌豆低聚肽硒螯合物具有良好的熱穩定性?？赡苁怯捎谕愣沟途垭闹痪哂械鞍踪|的一級結構，對溫度的耐受能力較強[16]。

表2 不同溫度下豌豆低聚肽硒螯合物分子質量分布Table 2 Molecular weight distribution of selenium-chelating pea oligopeptide at different temperature

圖1 不同溫度下豌豆低聚肽硒螯合物硒含量(*P<0.05)Fig.1 Selenium content of selenium-chelating pea oligopeptideat different temperature (*P<0.05)

2.4 豌豆低聚肽硒螯合物的酸堿穩定性

豌豆低聚肽硒螯合物在不同pH值條件下處理后，其分子質量分布如表3所示。在中性條件下，小于140 Da分子質量所占比例增加約10%，同列變化最大?？赡苁谴祟愋‰?尤其是分子質量小于500 Da)耐受酸堿環境，反而在中性條件下易斷裂。分子質量在1 000 Da之下的比例變化不大，最大變化率不超過3%?？蛇M一步證明肽鏈耐受酸堿環境。圖2中顯示了經過不同pH處理后硒含量的變化。在偏酸性和中性環境下，硒含量都顯著降低(a=0.05)，變化率在20%左右。在堿性環境中，硒含量變化較小。但在pH 3～11，硒含量仍在78%以上，說明豌豆低聚肽與硒螯合的產物對于酸堿環境仍具有很強的穩定性。

表3 不同pH值下豌豆低聚肽硒螯合物的分子質量分布Table 3 Molecular weight distribution of selenium-chelating pea oligopeptide at different pH

圖2 不同pH下豌豆低聚肽硒螯合物硒含量(*P<0.05)Fig.2 Selenium content of selenium-chelating peaoligopeptide at different pH (*P<0.05)

2.5 豌豆低聚肽硒螯合物的體外消化穩定性

豌豆低聚肽硒螯合物分別經過胃蛋白酶、胰蛋白酶、先胃蛋白酶再胰蛋白酶處理，分子質量分布結果如表4所示。豌豆低聚肽硒螯合物經過不同的體外消化方式處理后，分子質量在1 000 Da之下的部分所占的比例增加，其中，經過胃蛋白酶處理后的增加了約7%，經胰蛋白酶處理后的增加了約9%，先胃蛋白酶處理再胰蛋白酶處理后的增加了約12%。這證明了豌豆低聚肽經過酶的消化處理，分解成更小分子質量的肽段。經過酶解后，1 000 Da以下所占的比例都在90%以上，小分子肽段，特別是二肽、三肽更利于人體吸收[17。經過不同的消化方式處理后，豌豆低聚肽硒螯合物中硒含量變化較小。結合分子質量分布的變化表，豌豆低聚肽硒螯合物在經過酶的消化后，雖然被水解成小肽段，但是并沒有完全破壞硒與肽的配位結構，可以推測，豌豆低聚肽與硒的配位鍵較為穩定，不隨肽鏈的斷裂而破壞。則硒可隨小肽段穩定的經過胃液和腸液，最后在腸道中通過小腸黏膜對肽的吸收[18-19]而被間接吸收。

表4 不同消化方式下豌豆低聚肽硒螯合物的分子質量分布Table 4 Molecular weight distribution of selenium-chelating pea oligopeptide at different digestion mode

圖3 不同消化方式下豌豆低聚肽硒螯合物硒含量(*P<0.05)Fig.3 Selenium content of selenium-chelating pea oligopeptideat different digestion mode (*P<0.05)

3 結論

本研究以豌豆低聚肽和亞硒酸鈉為原料，制備出豌豆低聚肽硒螯合物，并對其基礎理化性質、熱穩定性、酸堿穩定性和消化方式穩定性進行了探究。實驗結果表明，豌豆低聚肽硒螯合物水分含量為(14.17±1.12)%，水分含量較低，能夠抑制大多數霉菌和葡萄球菌。酸溶蛋白含量為(23.22±0.12)%，總氮含量為(23.87±0.30)%，酸溶蛋白占粗蛋白的97.28%。分子質量分布在1 000 Da以下的占比超76%。小分子肽占比較大，利于人體吸收。

豌豆低聚肽硒螯合物對于熱處理具有良好的穩定性，經過不同溫度處理后，分子質量在1 000 Da以下的部分比例變化都低于2%，硒含量變化不顯著。對于酸堿環境也具有穩定性，經過酸或堿處理過后，分子質量在1 000 Da以下部分的比例變化低于3%，硒含量雖有一定變化，但仍在78%以上。對于不同消化方式也具有一定的穩定性，經過酶解后，分子質量在1 000 Da以下部分的比例都在90%以上，而硒含量變化較小。硒可進入腸道，通過黏膜對肽的攝入而被間接吸收，從而達到補充硒的功效。豌豆低聚肽硒螯合物可作為一種新型的補硒制劑，開發成適用于缺硒人群的營養與功能食品。