氣相色譜法測定發酵乳中的7種短鏈脂肪酸

丁巖，王娟，張迪

(Ofmom中國有限公司媽咪愛營養研發中心，北京，101300)

短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids, SCFAs)通常是指碳鏈中碳原子數少于6的有機脂肪酸，主要包括甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸和異戊酸等[1-3]。SCFAs存在于胃腸道中，對胃黏膜有一定的保護作用[4]。乳品在發酵過程中會產生SCFAs，SCFAs是發酵乳的主要風味營養物質之一[5]。

目前，最常用的測定SCFAs含量的方法有液相色譜法[6-9]、氣相色譜法[10-14]和質譜法[15-20]，其中高效液相色譜法雖然前處理操作簡單，但要求樣品基質簡單。對于基質復雜的樣品，例如發酵乳，則干擾過多，分離度差，定性及定量都較為困難，且需要消耗大量的有機試劑。對于氣相色譜法來說，由于羧基的極性較強，在氣相色譜柱中容易產生吸附作用，導致結果的重現性差，這種情況尤其在低濃度時會發生，因此SCFAs在進入氣相色譜柱前最好進行衍生化，同時衍生化還可以降低這些揮發性酸的蒸發損失[21]。質譜法具有檢測靈敏度高，定性準確的優點，但是對于小分子化合物(尤其是分子質量小于50的化合物，例如甲酸)，其在質譜上沒有響應或響應很低。氣相色譜-質譜聯用技術[15-18]基本采用的是全掃描模式，沒有充分利用質譜靈敏度高的優勢。采用頂空氣相色譜-質譜聯用技術[17-19]，存在的問題是，樣品的基質和標準系列的基質很難完全一致，準確定量存在困難。液相色譜-質譜聯用技術檢測SCFAs[20]，應用還不是很廣泛。另外質譜檢測成本過高。

綜合考慮，本方法選擇用衍生化方法進行前處理，由于衍生物中含有溴元素，所以選擇氣相色譜帶電子捕獲檢測器進行監測。本方法優化了復雜的衍生化前處理過程，使操作變得簡單、快速，消除了雜質干擾，提高了分離度，檢測結果準確、可靠，適用于發酵乳中各種SCFAs的測定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

發酵乳，實驗室自制；脫脂乳粉原料，雀巢公司；丙酮、正己烷，均為色譜純，默克集團；質量分數為1%的酚酞乙醇溶液、α-溴苯乙酮及18-冠-6醚，sigma公司；Na2HPO4、KH2PO4、H3PO4和KOH，分析純，百靈威公司；甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、異丁酸、異戊酸標準品，百靈威公司。

實驗室配制試劑：不同質量濃度(2、20、100 g/L)的KOH水溶液；體積分數為0.5%的H3PO4水溶液；磷酸鹽緩沖溶液[22](0.08 mol/L的Na2HPO4-KH2PO4水溶液，pH 6.8)：用0.08 mol/L的KH2PO4水溶液調節0.08 mol/L的Na2HPO4水溶液至溶液pH值為6.8；衍生化試劑[22](0.151 mol/L的α-溴苯乙酮和0.006 mol/L的18-冠-6醚混合的丙酮溶液)：稱取α-溴苯乙酮(2-溴苯乙酮)0.300 5 g和18-冠-6醚0.015 9 g于同一10 mL容量瓶中，用丙酮溶解并定容到10 mL刻度，充分混勻，根據用量現用現配。

1.2 儀器與設備

7890B氣相色譜(帶電子捕獲檢測器(ECD))，Agilent公司；Integral 5超純水系統，Millipore公司，水的電阻為18.2 MΩ；Centrifuge 5804R離心機，Eppendorf公司；DK-8D水浴鍋，常州諾基儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：DB-23石英毛細管柱(60 m×0.25 mm，0.25 μm)；進樣口溫度：270 ℃；檢測器溫度：280 ℃；分流比：150∶1；進樣量：1 μL；載氣：氮氣；載氣流速：1 mL/min；升溫程序：初始溫度50 ℃，保持10 min，然后以20 ℃/min速率升溫至170 ℃，以6 ℃/min速率升溫至230 ℃，保持9 min。

1.3.2 預處理

1.3.2.1 樣品預處理

取10 mL發酵乳于15 mL離心管中，10 000 r/min離心10 min后，取上清液4 mL(V2)于另一15 mL離心管中，加1～2滴酚酞，用KOH水溶液調上清液至微變淡粉色，此時樣品溶液呈弱堿性(強堿弱酸鹽電離呈弱堿性)， SCFAs以酸根形式存在。用超純水定容至5 mL(V1)刻度，混勻后10 000 r/min離心10 min，準備衍生化。如果樣品中待測物質濃度過高，可以將樣品在衍生化之前稀釋f倍后再進行衍生化處理。

1.3.2.2 標準系列預處理

分別稱取甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸各0.25 g到同一100 mL容量瓶中，用水定容到刻度，混合均勻。取4 mL配制好的標準溶液于15 mL帶5 mL刻度的離心管中，加1～2滴酚酞，用KOH溶液調至淡粉色，然后用水定容到5 mL刻度。此溶液為級別1混合標準溶液，將級別1混合標準溶液逐級稀釋，配制7個不同級別混合標準溶液。各級別混合標準溶液的質量濃度如表1所示。

表1 各級別標準溶液中7種SCFAs的質量濃度Table 1 The concentration of 7 SCFAs in each level

1.3.3 衍生化

取0.5 mL樣品上清液(或取0.5 mL表1中不同級別的混合標準溶液)于10 mL頂空進樣瓶中，加入2 mL磷酸鹽緩沖溶液，2 mL衍生化試劑和1 mL丙酮，加蓋密封，100 ℃水浴反應40 min，冷卻至室溫后，取0.7 mL衍生后的樣品于2 mL離心管中，加0.7 mL等體積的正己烷渦旋萃取，取正己烷層，進氣相色譜分析。衍生化反應式如圖1所示。

圖1 SCFAs衍生化反應方程式Fig.1 The derivative reaction equation of SCFAs

2 結果與分析

2.1 SCFAs的定性分析

在上述色譜條件下進行檢測，得到SCFAs各酸單標標準溶液的色譜圖和混合酸標準溶液的色譜圖，如圖2所示。

圖2 七種SCFAs各酸單標標準溶液的色譜圖和混合酸標準溶液的色譜圖Fig.2 The gas chromatogram of each single acid standard and 7 SCFAs mixed standard

由圖2可以看出，發酵乳中可能含有的7種SCFAs得到了很好的分離，保留時間分別為：乙酸25.745 min，甲酸25.884 min，異丁酸26.300 min，丙酸26.498 min，丁酸27.483 min，異戊酸27.729 min，戊酸28.760 min。

2.2 SCFAs的定量分析

一系列的混合標準溶液，按照上述的色譜條件進行測定，以各酸的質量濃度x為橫坐標，各濃度對應的峰面積y為縱坐標，制作標準曲線，根據式(1)計算樣品中的SCFAs的含量。

試樣中各個SCFAs的含量計算公式：

(1)

式中：X：試樣中各個SCFAs的含量，mg/L；C：從標準曲線上查得的試樣中各個SCFAs的質量濃度，mg/L；V1：樣品預處理時的定容體積，mL；V2：樣品預處理時的取樣體積，mL；f：樣品的稀釋倍數。

2.3 SCFAs的線性范圍、方法定量限和檢出限

將各個SCFAs配制成不同級別的混合標準溶液，各個級別的混合標準溶液分別調節pH值和衍生化處理，然后進氣相色譜檢測，各級別混合標準溶液中各酸質量濃度均為20～7 200 mg/L，根據SCFAs的定量分析方法(2.2)繪制各酸質量濃度和對應峰面積的關系圖，即各酸的衍生化效率圖，如圖3所示。

圖3 七種SCFAs的衍生化效率圖Fig.3 The derivatization efficiency graph of 7 SCFAs

各酸質量濃度在20～2 000 mg/L之間時，曲線均呈線性關系，隨著質量濃度繼續增大，從甲酸開始，衍生化效率逐漸下降，所以設定各個SCFAs的標準曲線線性范圍為質量濃度20～2 000 mg/L。

各酸質量濃度在20～2 000 mg/L線性范圍內的標準曲線方程，如表2所示，標準曲線線性關系良好，相關系數(R2)均大于0.999。當質量濃度為20 mg/L時，各酸的信噪比均>25，符合信噪比大于10作為定量限的要求，所以設置方法定量限為20 mg/L。

表2 七種SCFAs的線性回歸方程和定量限Table 2 The linear regression equations and quantitative limits of 7 SCFAs

注：x為質量濃度，mg/L；y為峰面積。

各酸質量濃度在5 mg/L時，如圖4所示，各個SCFAs均有檢出，信噪比在8.4～15.4，符合信噪比大于3作為檢出限的要求，所以設置方法檢出限為5 mg/L。

圖4 七種SCFAs的檢出限色譜圖Fig.4 The detection limit gas chromatogram of 7 SCFAs

2.4 SCFAs的加標回收率和精密度

取脫脂乳粉，配制成質量濃度為100 g/L的脫脂乳，做3個加標濃度，每個加標濃度做6個平行，測定回收率和精密度，結果見表3，結果表明該方法回收率高，重現性好。最低加標濃度設置在定量限上，即質量濃度為20 mg/L；由于甲酸和乙酸本底含量較高，所以甲酸和乙酸的最低加標濃度提高到質量濃度為50 mg/L。加標回收率和結果的相對標準偏差(RSD)均滿足實際樣品檢測的定量要求。

表3 七種SCFAs的加標回收率和精密度Table 3 The recovery and precision of 7 SCFAs mixed standard

續表3

物質名稱加標量/(mg·L-1)本底值/(mg·L-1)結果均值/(mg·L-1)回收率/%RSD/%異丁酸20.2819.9998.583.78101.400.00104.30102.863.71304.20321.43105.672.76戊酸21.4622.63105.442.40107.300.00111.49103.903.74321.90341.82106.192.88異戊酸21.7421.5899.283.32108.700.00111.57102.643.71326.10345.46105.942.78

3 討論

本方法中對標準系列進行預處理時，有兩種操作可以選擇，第一種先調pH值再逐級稀釋，就是本方法使用的操作；第二種就是先逐級稀釋再分別調pH值，分別稱取甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸各0.25 g到同一100 mL容量瓶中，用水定容到刻度，混合均勻。之后將此混合標準溶液進行逐級稀釋，分別吸取每個級別的混合標準溶液各4 mL，分別滴加1～2滴酚酞，用KOH調節至淡粉色，之后分別定容至5 mL刻度。經過結果比對區別很小，所以選擇先調pH值再逐級稀釋的方式，簡化操作。

本方法預處理過程中用KOH調節樣品和標準品溶液呈弱堿性，如果不慎KOH過量可以用0.5% 的H3PO4水溶液回調，不影響檢測結果。

本方法還可以用于其他水系樣品或可溶于水的樣品的SCFAs測定的參考，例如果汁，葡萄酒，糞便等。