基于D-S證據理論的數學模型優化補陽還五湯中多目標有效成分提取工藝*

馮 琛萬嘉洋姚 玥張 涵陳天翔 丁志山 李曉紅 虞 立 劉 佳 金偉鋒△

（1.浙江中醫藥大學第二臨床醫學院，浙江 杭州 310053；2.浙江中醫藥大學醫學技術學院，浙江 杭州 310053；3.浙江中醫藥大學第三臨床醫學院，浙江 杭州 310053；4.浙江中醫藥大學藥學院，浙江 杭州 310053；5.浙江中醫藥大學生命科學學院，浙江 杭州 310053）

補陽還五湯是清代醫學名家王清任所著，是中醫典籍《醫林改錯》所載的經典名方［1］。補陽還五湯對缺血性中風氣虛血瘀證的治療已取得共識，位居中醫益氣活血類代表方之首［2-3］。許多學者開展了大量的補陽還五湯臨床應用、作用機制及藥效物質基礎等系列研究，結果表明補陽還五湯治療缺血性中風具有較好療效，且用藥安全［4-6］。然而中藥復方乃至單味中藥成分復雜，有效成分含量甚少，何況有效成分往往不是單一成分，補陽還五湯亦是如此。

研究表明，羥基紅花黃色素A（HSYA）、阿魏酸、芒柄花素均是補陽還五湯中主要有效成分。HSYA是菊科植物紅花Carthamus tinctoriusL.的干燥花中的主要有效成分［7］，具有抗心肌、腦缺血損傷［8］，抗腦血栓形成，抗腫瘤，調節脂代謝等藥理作用。阿魏酸是傘形科植物當歸Angelica sinensis（Oliv.）Diels的干燥根和傘形科植物川芎Ligusticum chuanxiongHort.的干燥根莖中的主要有效成分［7］，具有抗氧化、清除自由基以及細胞保護等藥理作用［9］。芒柄花素是豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao 或 膜 莢 黃 芪Artragalus membranaceus（Fisch.）Bge.的干燥根的主要有效成分［7，10］，具有抗氧化，抗心腦血管等藥理作用［11］。

Dempster-Shafer（D-S）證據理論是一種研究不確定性問題的完整理論。它不僅能夠強調事物的客觀性，還能強調人對事物估計的主觀性。D-S證據理論將互不相關的基本問題組成的完備集合，表示對這一問題的全部可能答案，即D-S證據理論模型的基本解題方法。其具有采用“區間估計”對不確定性信息進行描述，而非“點估計”，在區別不知道、不確定和精確反映數據收集方面顯示出很大的靈活性等特點。現今D-S證據理論已在通信工程、航天航空、能源再生等領域廣泛運用［12-14］。遺傳算法（GA）是一種通過模擬生物自然進化和遺傳過程，搜索局部乃至全局最優解的方法和計算模型，是當今人工智能領域中解決最優化問題的搜索啟發式算法［15］。人工神經網絡（ANN）是一種模仿高等生物大腦神經元結構和功能的數學或計算模型，其中誤差反向傳播算法（BPNN）模型是ANN中的一種監督式的學習模型［16］。將GA與BPNN相結合，可使數據在多層結構網絡中的局部范圍內自動訓練、優化尋找最佳結果。但在當今人工智能大數據時代，將上述三者相結合的數學模型在中醫藥領域中還處于空白。

因此，本文采用D-S證據理論與GA-BPNN模型結合，對補陽還五湯中HSYA、阿魏酸、芒柄花素3種主要有效成分進行提取工藝優化、預測，得到最佳提取工藝，最后驗證模型的準確性。

1 儀器與材料

梅特勒XS205電子天平，METTLER TOLEDO國際有限公司；CASCADA BIOMK2超純水儀，美國PALL公司；HH系列數顯恒溫水浴鍋，上海江星儀器有限公司；SHZ-D（Ⅲ）循環水式真空泵，鞏義市予華儀器有限責任公司；Waters Alliance高效液相色譜儀（2695分離單元、2489紫外檢測器、Waters Empower工作站），美國Waters公司。

HSYA對照品（批號SZ201702005QA，質量分數≥98%），芒柄花素對照品（批號20170503，質量分數≥98%），天津士蘭科技有限公司，阿魏酸對照品（CAS：1135-24-6，質量分數≥98%）；黃芪 （甘肅，批號170901）、川芎（四川，批號 170901）、當歸（甘肅，批號171101）、赤芍（內蒙古，批號 180501）、桃仁（陜西，批號 180401），紅花（甘肅，批號 180401），地龍（廣東，批號180301），均購于浙江中醫藥大學中藥飲片有限公司，經浙江中醫藥大學藥學院馬永敏研究員鑒定，均符合2015年版《中國藥典》相關規范要求。

軟件為Matlab開發的中藥材藥物提取數據優選系統V2.0軟件，D-S證據理論程序包。

2 方法與結果

2.1 HSYA、阿魏酸、芒柄花素的HPLC同時測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱為ZORBAX Eclipse XDB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為乙腈-0.2%磷酸水溶液，采用梯度洗脫程序：0～25 min，5%～18%乙腈；25～55 min，18～55%乙腈；55～70min，55～80%乙腈；70～80 min，80%乙腈； 流速 1.00 mL/min； 檢測波長230 nm；柱溫箱為25℃；進樣量10 μL。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取HSYA、阿魏酸和芒柄花素對照品適量，分別置于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度線，充分搖勻，配成1 mg/mL的單一成分母液。分別精密吸取上述HSYA、阿魏酸對照品母液各2 mL，芒柄花素對照品母液1 mL，置于同一個10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度線，搖勻，得到混合對照品溶液（HSYA 0.20 mg/mL、阿魏酸 0.10 mg/mL、芒柄花素0.1 mg/mL）。

2.1.3 補陽還五湯復方溶液提取制備 按照補陽還五湯復方藥材比例稱取藥材10 g，精密稱定，置于圓底燒瓶中，精密加入60%乙醇350 mL，稱取質量，在80℃下熱回流提取2 h，室溫下冷卻，補足減少的質量，搖勻，抽濾，得到提取藥液。將藥液旋轉蒸發至近干，用適量甲醇溶解，轉入50 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，過0.22 μm微孔濾膜，得到供試品溶液。

2.1.4 系統適應性試驗 儀器分別自動進樣混合對照品溶液、供試品溶液各 10 μL，按“2.1.1”項下方法測定。3種成分達到基線分離，分離度大于1.5，色譜圖見圖1。

圖1 HPLC圖

2.1.5 線性關系的考察 混合對照品溶液作為1號溶液，對混合對照品溶液進行倍比稀釋，制成一系列質量濃度溶液，即2～6號溶液。按照“2.1.1”項下色譜條件測定物質峰面積，以對照品質量濃度為橫坐標（X），對應的峰面積為縱坐標（Y），制作標準曲線，得到回歸方程。HSYA：Y=5 946.87X-22.3486，R2=0.9995，在 0.02～0.20 mg/mL范圍內具有較好線性關系；阿魏酸Y=50 458.12X-14.9545，R2=0.9989， 在 0.02～0.20 mg/mL 范圍內具有較好線性關系；芒柄花素Y=57 127.25X+10.6913，R2=0.9991，在 0.002～0.10 mg/mL 范圍內具有較好線性關系。

2.1.6 精密度試驗 自動進樣3號混合對照品溶液10 μL，按“2.1.1”項下條件重復進樣 6次，記錄混合對照品溶液中HSYA、阿魏酸和芒柄花素的色譜峰面積并計算RSD值分別為0.89%、0.43%、0.74%，表明精密度良好。

2.1.7 穩定性試驗 按照“2.1.3”項下方法制得供試品溶液 1 份，按“2.1.1”項下條件分別在 0、2、4、6、8、12、24 h進樣，記錄HSYA、阿魏酸和芒柄花素的色譜峰面積，供試品溶液色譜峰面積的RSD值分別為2.00%、1.88%、1.56%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.1.8 重復性試驗 按補陽還五湯復方藥材 （同一批次）的比例稱取藥材10 g，精密稱取6份，按“2.1.3”項下方法制得供試品溶液，高效液相色譜法測定，記錄HSYA、阿魏酸和芒柄花素的色譜峰面積，計算得其質量分數的RSD值分別為2.65%、1.33%、2.92%，表明該方法重復性良好。

2.1.9 回收率試驗 按補陽還五湯復方藥材 （已測定的同批次藥材）的比例稱取藥材5 g，精密稱定，共6份，按照“2.1.3”項下方法制備提取樣品溶液，每份各精密加入HSYA對照品1 mg、阿魏酸對照品0.50 mg和芒柄花素對照品0.05 mg，制備供試品溶液，按照色譜條件進行測定，HSYA的平均回收率為108.57%，RSD為2.13%；阿魏酸的平均回收率為101.49%，RSD為1.84%；芒柄花素的平均回收率為98.98%，RSD為1.87%，說明該方法回收率良好。

2.2 響應面試驗設計

2.2.1 因素水平設計 基于單因素試驗的基礎上，確定補陽還五湯復方中3種有效成分提取率的4個因素：提取時間（A）、乙醇體積分數（B）、提取溫度（C）、液料比（D），最后進行四因素五水平的響應面試驗設計，篩選最佳提取工藝。見表1。

2.2.2 試驗方法 按補陽還五湯復方藥材的比例稱取藥材8 g，共30份，按照響應面試驗設計方法進行乙醇熱回流提取，放冷，抽濾，旋轉蒸發至盡干，用適量甲醇溶解，轉入50 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，得到30個樣品溶液，密封置于冰箱內備用。最后按照“2.1.3”項下方法測定HSYA、阿魏酸和芒柄花素的提取率。提取率＝各成分的量/生藥材量，結果見表1。

2.3 D-S證據理論方法下的權重賦值

各個成分進行歸一化處理，即各成分的每個數除以這組數之和。然后依據D-S證據理論程序包求得歸一化常數K=0.0988，各成分相關系數：AHSYA=1/36 530，B阿魏酸=1/7 159.5，C芒柄花素=1/1 190.6。 最終得到權重賦值公式：綜合評價值=1/0.0988×提取率HSYA/36 530×提取率阿魏酸/7 159.5×提取率芒柄花素/1190.6×100 000，結果見表1。

表1 響應面試驗設計方案及結果（n=3）

2.4 RSM軟件分析結果

采用Design-Expert.V8.0.6響應面軟件對上述響應面方法提取后計算得到的綜合評價值進行分析：模型的P值＜0.0001，提取時間的PA為0.2073，乙醇濃度的PB為 0.5893，提取溫度的 PC為 0.0321，液料比的PD為0.0023，R2=0.9086。模型的方程為：綜合評價值=-3 194.14+35.95×A+9.91×B+62.97×C+12.52×D+0.12×A×B-0.09×A×C+2.24×A×D-0.03×B ×C-0.07×B×D+0.12×C×D-19.10×A2-0.06×B2-0.34×C2-0.83×D2。 同時得到預測結果為：提取時間1.7 h，乙醇濃度53%，提取溫度91℃，液料比14∶1，該條件下預測得到的綜合評價值為66.75。

2.5 Matlab環境下的模型優化

本文采用Matlab開發的中藥材藥物提取數據優選系統V2.0軟件，其中包含BPNN工具包 （newff）和GA工具箱，網絡結構為3層（即輸入層：提取時間、乙醇濃度、提取溫度、液料比；中間層：隱層神經元個數；輸出層：綜合評價值），不斷調整軟件中的參數使之符合實驗需要。將30組數據的第1～27組（共27組）作為神經網絡模型的訓練數據，第28～30組（共3組）作為評判神經網絡模型優劣的驗證數據，導入到神經網絡（參數設置：現實頻率為5，訓練次數為100，訓練目標最小誤差為0.001，其余為默認值）中，結合GA工具箱（參數設置：種群規模為100，最大迭代次數為1 000，滿意的適應值為0.0005，梯度下降為10～15，其余為默認值），不斷調整神經元數量，對網絡模型進行訓練優化，得到擬合誤差（%）、預測誤差（%）、總體誤差（%）、模型擬合率（R）等4個結果，見表4；實驗數據和理論數據擬合結果見圖2。

圖2 實驗數據和理論數據相關性分析結果

從表2可知，神經元個數從1～6，擬合誤差由大變小后再變大，即出現了統計學中的過擬現象，當神經元為5時，結果都較其他神經元個數時好，其擬合誤差為6.22%、預測誤差為3.46%、總體誤差為4.84%、模型擬合率R為0.9969；從圖2可知，當神經元變化從1～5時，所有的數據愈來愈靠近對角斜線（相關性斜線）；當神經元為5時，所有數據基本與相關斜線重合；而神經元為6時，有些數據又開始逐漸偏離相關性斜線，這也恰好印證了模型優化參數在圖中的變化過程。因此，本文選取神經元個數為5進行下一步數據預測。

表2 模型優化參數

2.6 模型的目標尋優

基于上述神經網絡模型，本文進行實數編程，再次建立GA模型（參數設置：種群規模為100，最大迭代次數為1 000，滿意的適應值為0.0005，梯度下降為10～15，其余為默認值），進行目標結果尋優。得到的結果如下：提取時間1.7 h，乙醇濃度50%，提取溫度90℃，液料比16∶1，網絡預測綜合評價值為77.20。

2.7 驗證試驗

按上述得到的兩種提取優化工藝條件，按復方比例稱取80 g藥材，共8份，進行乙醇熱回流提取驗證試驗，測定各成分的提取率，結果見表3。由表3可知，RSM法實驗平均綜合評價值為70.82，其RSD為2.64%，預測值為66.75；GA-BPNN法下的實驗平均綜合評價值為76.47，其RSD為1.49%，預測值為77.20。上述驗證試驗顯示，RSM法的預測值較GA-BPNN模型低，且低于30組實驗中的第3組，故尋優結果較劣；RSM法的驗證試驗真實值也較差于遺傳神經網絡模型的，故D-S證據理論下的遺傳神經網絡模型優于響應面法，即本文最佳的提取工藝條件選擇GA-BPNN模型所給出的結果，即提取時間1.7 h，乙醇濃度50%，提取溫度90℃，液料比16∶1。

表3 兩種方法最佳工藝下的驗證試驗

3 結 論

基于單因素實驗的基礎上，最終選取提取時間、乙醇濃度、提取溫度、液料比4個因素，采用四因素五水平的響應面設計方法，進行乙醇熱回流提取補陽還五湯中的HSYA、阿魏酸、芒柄花素3種成分，得到的提取率利用D-S證據理論方法得到綜合評價值。利用RSM法和GA-BPNN模型同步對綜合評價值進行最佳工藝優化和預測，驗證結果發現：GA-BPNN模型得到的最佳提取工藝條件優于RSM法。

本文基于D-S證據理論數據處理方法，采用當前較為常用的RSM法和熱門的GA-BPNN模型對中藥復方補陽還五湯中的HSYA、阿魏酸、芒柄花素3種成分進行提取工藝優化和預測。結果發現GA-BPNN模型在中藥有效成分多目標尋優中效果顯著，簡便快捷，這也為中藥有效成分多目標尋優、發現其藥效物質基礎和實現現代化中藥研究提供了新的思路和參考。