中風1號對急性期腦出血大鼠Bcl-2、Bax蛋白表達的影響*

梁 群 王 叢 朱永志△

（1.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫藥大學，黑龍江哈爾濱 150040）

腦出血屬于中醫出血性中風范疇［1］。如何降低腦血管疾病的死亡率和致殘率一直是醫學界要攻克的重點。隨著醫學界的專家們對急性腦血管疾病的不斷探索，應用中醫中藥治療急性腦出血逐漸受到國內外專家的重視，臨床研究也顯示療效顯著［2-4］。中風1號為本文通信作者朱永志教授總結四十余年治療急性期腦出血經驗形成的方劑，主要功效為活血化瘀。腦出血多為瘀阻腦竅，瘀血在急性期不除反而阻礙腦組織血運循環使致殘率增加。前期動物實驗發現中風1號可以減輕腦水腫、保護神經組織［5］，為中醫內科保守治療急性腦出血奠定了基礎。本次實驗研究將在前期研究的基礎上進一步明確中風1號治療急性期腦出血的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級別SD雄性大鼠40只，許可證號 SCXK（京）2016-0006，體質量 180～220 g，由黑龍江中醫藥大學動物實驗中心代為購買。普通專用飼料喂養于溫度（22±4）℃，相對濕度40%～70%，自然光線的實驗室，經過1周的適應性飼養后進行實驗。本實驗嚴格遵守動物福利與倫理原則，在黑龍江中醫藥大學實驗動物管理和使用委員會監督下進行，倫理號2017092001。

1.2 試藥及儀器 1）試劑：兔抗大鼠Bcl-2、Bax多克隆抗體購自Abcam公司；即用型快速免疫組化Max VisionTM試劑盒及 DAB顯色試劑購自北京中杉金橋生物技術有限公司。2）藥物：中風1號（組成：水蛭10 g，生大黃10 g，澤瀉15 g，三七粉10 g，生地黃15 g。由黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院制劑室熬制），按動物體表面積比率換算大鼠灌胃量，常規水煎至3.5 g/mL（每毫升含生藥3.5 g）。阿莫西林鈉舒巴坦鈉（哈藥集團生產，批號17070703-2），甘露醇（石家莊四藥有限公司生產，批號1709130503）。3）儀器：大小鼠腦定位儀（上海玉研科學儀器有限公司生產）、腦立體定位進樣針（上海玉研科學儀器有限公司生產）、動物顱骨鉆（上海玉研科學儀器有限公司生產）、切片機 （德國萊卡生產）、超凈工作臺（蘇凈安泰生產）、光學顯微鏡（日本奧林巴斯公司生產）。

1.3 分組及造模 SD大鼠40只隨機分為4組，每組10只，分別為假手術組、模型組、中風1號組、甘露醇組。除假手術組外，其余大鼠參照文獻［6］的方法制備模型。用10%水合氯醛按大鼠體質量計算麻醉藥用量進行腹腔注射麻醉。大鼠俯臥位固定于立體定位儀上，充分暴露囟門消毒備皮后切開大鼠頭頂部正中線皮膚約1 cm，暴露骨膜及前囟點，在前囟點右側3.5 mm，后0.2 mm處用牙科鉆鉆出直徑約1.0 mm的圓孔，深達硬腦膜表面。同時鼠尾用酒精消毒，距尾末端3 cm處剪斷用微量注射器抽取50 μL血液，把微量注射器固定在立體定位儀上，針頭沿鉆孔進針約6 mm，以20 μL/min速度將50 μL血液緩慢推進腦組織，留針觀察約5 min后緩慢出針。在留針期間包扎大鼠尾部傷口。取適量牙科水泥用純凈水調成糊狀封閉顱骨創口，待牙科水泥略干后縫合頭皮并用碘酚局部消毒，可在傷口表面撒適量抗生素以防止感染影響指標變化。假手術組：動物接受與模型組相同的操作但腦組織不注血。

1.4 給藥方法 在造模后2 h大鼠完全蘇醒后開始計時，中風1號組每日2 mL中藥湯劑（劑量約為成人用量的1倍）灌胃，假手術組、模型組每日等量生理鹽水灌胃，甘露醇組給予大鼠尾靜脈注射甘露醇0.5 g/（kg·d），共給藥 3 d。

1.5 標本采集與檢測 給藥3 d后，大鼠吸入麻醉后頸椎離斷處死，開顱取腦，以針道為中心，前后各移動2 mm切取4 mm厚腦組織。將切片浸于二甲苯中脫蠟0.5～1 h，乙醇脫水（步驟為 100%乙醇 5 min、100%乙醇5 min、95%乙醇5 min、80%乙醇5 min），蒸餾水沖洗。在室溫下切片，用3%甲醇雙氧水封閉20～30 min，自來水沖洗；采用高壓修復之后放入PBS中。然后用免疫組化筆將組織圈住，切片上滴加山羊血清封閉液，保持在室溫20～30 min。甩去多余液體，不洗，再在切片上滴加目的一抗，4℃過夜，次日取出來后待切片恢復至室溫后，放入PBS洗3次，每次5 min。切片上滴加二抗，37℃避光20 min后，放入PBS中洗3次，每次5 min，然后滴加DAB染液顯色5～10 s，水洗終止顯色。最后采用蘇木素復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，封片完成。選擇各組的陽性和陰性組織相進行顯微照相；選擇各組有意義的組織相進行讀取分析，最后存盤。顯微鏡下Bcl-2和Bax陽性反應物在胞漿或胞核有棕色顆粒者為陽性細胞，計數陽性細胞。

1.6 統計學處理 應用SPSS19.0統計軟件。計量資料以（±s）表示，符合正態分布的采用獨立樣本t檢驗，不符合的用秩和檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

見表1，圖1，圖2。假手術組3 d后僅有少量Bcl-2、Bax陽性細胞，與假手術組比較其余各組血腫周圍腦組織Bcl-2、Bax陽性細胞數均明顯增多。模型組Bc1-2蛋白、Bax蛋白與中風1號組、甘露醇組比較差異均具有統計學意義（P＜0.05）。中風1號組與甘露醇組Bcl-2/Bax比值遠大于1，中風1號組與甘露醇組比較治療效果更顯著（P＜0.05）。

表1 各組 Bcl-2及 Bax陽性細胞數比較（個，±s）

表1 各組 Bcl-2及 Bax陽性細胞數比較（個，±s）

與模型組比較，*P＜0.05；與甘露醇組比較，△P＜0.05

組 別 n Bcl-2/Bax Bcl-2 Bax假手術組 10 1.03±0.03模型組 10 0.79±0.06甘露醇組 10 1.30±0.74*1.75±0.64 1.70±0.82 23.00±3.38 29.50±4.38 30.80±4.16* 23.40±2.91*中風 1號組 10 1.75±0.26*△35.60±2.37*△ 20.70±1.70*△

圖1 各組大鼠腦組織Bax蛋白的表達（免疫組織化學法，400倍）

3 討 論

圖2 各組大鼠腦組織Bcl-2蛋白的表達（免疫組織化學法，400倍）

腦出血一直是臨床上的常見病，因其發病率和致殘率均很高，造成的家庭負擔較重，故受到醫學界的廣泛重視。經多年研究，中醫藥治療腦出血逐漸得到醫學界的認可。中醫理論中認為出血性中風為血不循經、血溢脈外引起的離經之血積蓄于腦［7-8］，血不循經可因氣虛不固攝血液、肝陽上亢等多種因素引起，以往一致認為急性期腦出血應用活血化瘀藥物會加重出血或引起再出血，所以以前活血化瘀一直是急性期腦出血的治療禁區［9］。但隨著醫學界對腦出血的不斷研究與探索發現：但凡血液不能滋養周身，溢出脈外，即使是鮮血亦都歸屬于瘀血范疇，即“離經之血即為瘀”［10-12］。

朱永志教授根據多年臨床經驗認為腦出血的形成即為瘀血阻滯于腦絡，離開經脈循行的血液就已經成為瘀血。瘀血貫穿于出血性中風的始終［13］。所以在腦出血急性期辨證用藥時活血化瘀為針對其病因病機用藥，加之合理的君臣佐使相配伍能共同達到救治目的。朱永志教授一直從事中醫神經內科疾病的研究工作，在應用中醫中藥治療神經系統疾病尤其是出血性中風的研究及診治方面積累了豐富的臨床資料和寶貴經驗。中風1號是朱永志教授依據多年臨床經驗總結出的中藥湯劑，其由水蛭、生大黃、澤瀉、三七粉、生地黃組成。其中水蛭功擅破血、逐瘀消癓。大黃取其活血祛瘀之效用于血熱妄行致血不歸經出現的腦出血。澤瀉可利水滲濕泄熱，減輕腦水腫降低顱內壓。三七粉化瘀止血使瘀血不留于絡。生地黃清熱養血，養陰生津。水蛭為君，生大黃為臣，其余為佐使藥，諸藥共奏活血祛瘀之功效。

本實驗在大量臨床觀察基礎上驗證中風1號治療急性期腦出血的作用機制。當急性腦出血發生時腦組織處于缺血缺氧狀態，Bc1-2和Bax會保護性增高［14］。但Bax的高表達會抑制Bc1-2的表達而加重腦組織損傷［15］。本實驗研究通過自體尾靜脈注血制作大鼠急性腦出血模型，通過3 d的給藥發現，中風1號可使腦組織缺血缺氧改善，Bc1-2表達增加而Bax表達減少，Bc1-2/Bax值增加。證實中風1號可通過調控腦出血大鼠細胞凋亡基因減輕腦出血后的神經損傷，為臨床上中風1號治療急性期腦出血提供依據，再次證實中藥可以治療急危重癥。