雙參通脈顆粒對急性心肌缺血再灌注后的大鼠心肌細胞保護作用的影響*

吳 迪 劉 彤 楊 鶯△

（1.遼寧中醫藥大學，遼寧 沈陽 110032；2.遼寧中醫藥大學附屬醫院，遼寧 沈陽 110032）

急性心肌梗死（AMI）是一類非常嚴重的缺血性心臟病，主要指由冠狀動脈急性、持續性缺血缺氧引起的心肌壞死。AMI有起病急，致死致殘率高等特點，已成為威脅人類健康的重要原因［1］。目前，缺血性心臟病的發病率呈逐年上升趨勢，缺血性心血管病占我國心血管病總發病數的65%［2］。而心梗后心肌在得到再灌注的同時也伴隨著一系列的心臟和血管的不良事件，如心律失常、心肌收縮功能障礙、甚至無復流等影響心肌缺血預后的事件［3］。心肌梗死在中醫學屬“胸痹”“心痛”范疇，中醫學認為心肌梗死病機屬本虛標實，本虛以氣陰虧虛為主，不榮則痛；標實則是血瘀痰飲痹阻脈絡，不通則痛。而雙參通脈顆粒在養陰通脈治法的指導下對急性心肌梗死起到治療作用。研究表明，炎癥反應是造成心肌缺血再灌注損傷的重要原因之一［4-5］。血管細胞黏附分子 （VCAM-1）是組織炎性反應的主要因子，在炎癥發生過程中發揮重要作用，與心腦血管疾病有密切關系［6］。 腫瘤壞死因子-α（TNF-α）與心肌缺血再灌注損傷具有密切相關性［7］，TNF-α主要由單核細胞和巨噬細胞產生，并與多種心臟疾病，如心力衰竭、缺血性心肌病等有關的一種炎性因子，而炎癥反應可進一步加重心肌缺血損傷，也是心肌缺血再灌的主要病理機制之一［8］。本實驗通過觀察心肌組織中 VCAM-1、TNF-α的表達情況及光鏡（HE染色）下觀察心肌組織的病理改變來間接判斷基于養陰通脈法指導下的雙參通脈顆粒對心肌缺血再灌注損傷心肌的治療效果。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康SD大鼠，10～12周齡，雄性，體質量 250～280 g，共 40只，動物許可證號 SYXK（遼）2016-0063，自由飲水，由遼寧中醫藥大學動物實驗中心提供。

1.2 試藥與儀器 1）藥物：雙參通脈顆粒（遼寧中醫藥大學附屬醫院心內科，批號20160531），由人參、丹參、黃芪、麥冬、川芎、當歸6味藥組成；西藥合心爽（天津田邊制藥有限公司，批號1411087）；麻醉藥水合氯醛（上海化學試劑有限公司，批號20130413，20131127）現用現配；2）試劑：VCAM-1、TNF-α酶聯免疫吸附試驗法（ELISA）檢測試劑盒（美國凱基生物有限公司，批號分別為 141425、141306）。3）儀器：DMS300Leica 圖像分析儀 （德國Leica公司）；HL-B6型小動物呼吸機（北京新利科技有限公司）；CA52-3型全自動生化分析儀（長沙湘江儀器公司）；5234R型高速離心機（德國Eppdendorf公司）；OM3123型冰凍切片機（瑞典Bio公司）；恒溫恒濕箱（上海科技生物公司）。

1.3 分組和造模［9］健康SD大鼠40只，隨機分為對照組、模型組、中藥組、西藥組，每組10只。對模型組、中藥組、西藥組動物進行造模，復制急性心肌缺血再灌注模型。取大鼠稱質量，采用10%水合氯醛按0.3 mL/100 g，腹腔麻醉后固定于手術臺上，記錄結扎前5 minⅡ導聯心電圖，然后剪毛、消毒、鋪巾，無菌下常規切開胸骨、心包、暴露出心臟，并于左冠狀動脈前降支起始下2 mm處結扎，可見左心室前壁光澤度降低，并變蒼白無血色，大鼠心臟搏動減弱，記錄結扎后5 min、30 min和2 h的心電圖，采用多導生理記錄儀監測顯示心電圖標準Ⅱ導聯，ST段抬高和（或）T波抬高（圖1：造模前后Ⅱ導聯心電圖變化）。將以上標志作為急性心肌梗死建模成功的標志。結扎持續30 min后，打開結扎線。不結扎正常對照組，檢查無出血后，將胸腔逐層關閉。

圖1 造模前后Ⅱ導聯心電圖變化

1.4 干預方法 空白對照組與模型組，用生理鹽水3 mL/kg進行連續灌胃2周，每日1次。中藥組予雙參通脈顆粒劑，用生理鹽水制成3 mL/kg的混合液，相當于生藥量11 g/kg。西藥組予合心爽用生理鹽水制成3 mL/kg混合液，質量濃度4.23 mg/kg。各組連續灌胃2周，每日1次。

1.5 標本采集與檢測 1）心肌組織病理檢測。2周后，實驗動物麻醉后，打開胸腔，摘取心臟，置于無菌的生理鹽水中，立即取下1 mm3的缺血心肌組織數塊，分別置于10%的甲醛液中固定進行TUNEL，-80℃冰箱中冷藏用作光鏡下病理檢測。2）血清中VCAM-1檢測。造模成功后，開腹并暴露腹主動脈，經腹主動脈采血5mL，低溫離心后取上層血清，試管編號，相關步驟嚴格按照酶聯免疫試劑盒要求進行測定，并計算出各樣本血清濃度。3）血清TNF-α含量檢測。經腹主動脈負壓采血5 mL左右，低溫離心取上層血清，試管編號后，ELISA法檢測血清TNF-α含量，按試劑盒說明書進行測定：將所用抗原用包被稀釋液稀釋到適當濃度，5%小牛血清置37℃封閉40 min，洗滌液滿孔洗滌3遍，每遍30 min，將稀釋好的樣品加入酶標反應孔中，每樣品至少加雙孔，37 ℃，40～60 min，加入酶標抗體，37 ℃，30～60 min，加入底物液，37℃避光放置3～5 min，加入終止液顯色，25 min內測定。

1.6 統計學處理 應用SPSS for Windows軟件包進行方差分析、q檢驗等統計學分析處理，計量資料以（±s）表示。組間比較均采用多重比較SNK-q方法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 光鏡下大鼠心肌組織病理改變 見圖2。心肌組織切片HE染色，可見空白對照組心肌組織無明顯變性、壞死，心肌纖維排列較規則，染色均勻，橫紋清晰，組織間隙水腫較輕，僅有輕度淤血等改變；模型組有部分心肌局灶性壞死，心肌纖維斷裂，染色疏松，細胞及組織間隙水腫明顯，心肌間質有出血，炎細胞浸潤；中藥組及西藥組示心肌纖維較模型組排列規整、斷裂較少，組織間隙水腫較輕，心肌間質輕度出血。

圖2 各組心肌細胞病理改變（HE染色，200倍）

圖3 各組心肌細胞VCAM-1表達

2.2 各組大鼠血清VCAM-1心肌組織中的表達比較見圖3，表1。對照組中VCAM-1在心肌血管內皮細胞呈微弱的陽性表達，中藥組和西藥組中，有少量VCAM-1在心肌細胞間質和血管內皮細胞呈陽性表達，模型組可見VCAM-1在心肌細胞間質和血管內皮細胞中呈強陽性表達，陽性反應產物呈棕黃色，且強度增強和范圍擴大。

表1 各組大鼠血清VCAM-1含量比較（±s）

表1 各組大鼠血清VCAM-1含量比較（±s）

與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與中藥組比較，△P＜0.05。 下同

組 別 n 面積 灰度對照組 10 7209.50±1611.79 2773.30±695.35模型組 10 45081.60±4222.11*△ 19762.39±11840.51*中藥組 10 15251.10±1814.35*# 6412.99±1814.35*#西藥組 10 21686.00±1965.96*#△ 8992.41±623.12*#△

2.3 各組大鼠血清TNF-α心肌組織中的表達比較見表2。結果顯示，模型組與對照組相比TNF-α的表達程度明顯升高，中藥組和西藥組中TNF-α的表達程度較低。

表2 各組大鼠血清TNF-α含量比較（±s）

表2 各組大鼠血清TNF-α含量比較（±s）

組 別 n 面積 灰度對照組 10 7698.40±1023.52 3185.48±372.71模型組 10 52617.90±13586.60* 21674.45±3974.23*中藥組 10 13829.60±3252.91*# 5687.64±1002.32*#西藥組 10 19574.50±4719.00*#△ 8607.63±2563.20*#△

3 討 論

本研究采用大鼠急性心肌梗死模型，通過比較大鼠心肌組織病理變化及各組間心肌組織 VCAM-1及TNF-α的表達情況，分析了基于益氣養陰法指導下的雙參通脈顆粒對心肌缺血再灌注后大鼠心肌組織的氧化損傷的影響。本實驗結果顯示西藥組和中藥組VCAM-1和TNF-α的表達與模型組相比有明顯下降（P＜0.05）。說明雙參通脈顆粒對心肌缺血再灌注后的心肌組織具有一定的保護作用。且現代藥理研究已證實中醫藥對減輕炎癥反應、改善心肌組織損傷等多個方面均具有效果［9-10］，藥物對缺血再灌注損傷的防治作用以其有效及可控性好等優勢得到研究者的廣泛重視［11］。 中醫學認為，心肌梗死屬“胸痹”范疇，張仲景在《金匱要略》中提到“夫脈，當取太過不及。陽微陰弦，即胸痹而痛”。所以胸痹病機為本虛標實：其中本虛則以氣虛、陰傷為主，氣虛無力行血，陰傷即津液、精血虧虛，不足以濡養心神，氣陰雙虧，使心脈失養，不榮則痛。標實主要以痰瘀互結為主，氣為血之帥，由于氣虛導致機體推動、氣化無力，故瘀血停留，必然影響心主血脈之功能。氣虛也可導致機體津液轉運、疏布、排泄異常，津液集聚，凝煉為痰，此外中氣虧虛，脾胃不能很好運化水濕，也能聚濕生痰。瘀血疾濁互結，心脈氣機受阻而發生胸痹［12］。所以益氣養陰通脈為中醫治療胸痹的治療原則，雙參通脈顆粒是在益氣養陰通脈法的指導下，由人參、麥冬、當歸、黃芪、丹參、川芎6味藥物組成，其中人參為大補元氣之品，入心經，具有生津養血之功效；當歸、丹參均可補血活血；人參、當歸、黃芪配伍合用，共奏補益氣血之效。方中麥冬具有養陰生津的作用；川芎為血中之氣藥，具有良好的活血行氣之功效，與丹參、當歸合用可增強其補血化瘀之功效，通達氣血，使補而不滯；黃芪在《神農本草經》中歸屬于上品，《醫學衷中參西錄》謂其“能補氣，兼能生氣，善治胸中大氣下陷”，前期研究也證明，黃芪皂苷用于大鼠心肌缺血再灌注損傷時，能改善心肌能量代謝，增強心肌收縮力，改善心肌缺血［13］。川芎可改善心肌細胞的肥大［14］。所以此方6味藥物通過益氣養陰、活血通脈標本兼治的方法來達到治療心肌梗死的作用。本文觀察結果證實，雙參通脈顆粒對心肌缺血再灌注損傷具有良好的療效，能有效降低心肌梗死后再灌注大鼠心肌細胞VCAM-1及TNF-α的含量，保護損傷的心肌組織，為其在臨床的推廣使用提供一定的理論依據。目前隨著中醫藥在臨床的應用不斷發展，中醫藥治療已經取得了一定的效果。許多臨床和實驗研究表明中藥有改善心肌缺血狀態，降低血管炎性反應等作用［15］。以往臨床常以西藥作為主要治療方案，總體療效欠佳［16］。中藥將為心肌梗死的治療、提高患者生活水平提供新的途徑，對于臨床心肌缺血的治療有著重要的指導意義。