蛇床子素通過PI3K-AKT信號通路誘導HaCaT細胞凋亡的研究*

胡惠清 李 靜 方 坤 盧彩紅 呂保先 龍劍文

（1.湖北省武漢市第九醫院，湖北 武漢 438000；2.湖北中醫藥大學第一臨床學院，湖北 武漢430061）

銀屑病是一種復雜的炎癥性皮膚病，其中涉及到炎癥細胞，角質形成細胞，血管內皮細胞之間復雜的相互作用［1］。銀屑病皮損中角質形成細胞存在過度增殖和角化不全等現象，是一種表現為表皮動力學紊亂為特征的慢性炎癥［2］。人磷酸化磷酸肌醇3激酶-蛋白激酶B（PI3K-AKT）通路信號轉導通路對于細胞的增殖和抗凋亡起著至關重要的作用［3-4］。既往的研究表明PI3K-AKT通路在銀屑病角質形成細胞的異常增殖中發揮重要作用，異常的角質形成細胞在一系列內外因素的作用下，通過啟動PI3K-AKT信號轉導通路，誘導細胞的過度增殖，避免細胞發生凋亡，對維持細胞高增殖的生物學特性發揮了重要作用［5］。蛇床子素是中藥蛇床子的主要活性成分之一，具有廣泛的藥理活性，包括抗腫瘤、解痙、降血壓、增強免疫功能及廣譜抗菌作用等［6］。本研究通過體外細胞培養的方法，研究了不同濃度蛇床子素對人永生化角質形成細胞株 （HaCaT細胞）細胞增殖和凋亡的影響以及對PI3K-AKT通路的調控和下游凋亡相關蛋白表達的影響。結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

蛇床子素粉劑購于美國Sigma公司。HaCaT細胞購自中國科學院上海細胞生物學研究所。

1.2 試劑和儀器

100 U/L青霉素，100 mg/L鏈霉素購自武漢博士德生物公司；DMEM干粉、小牛血清和胰蛋白酶購自GIBCO公司，CCK-8試劑盒購自武漢博士德生物公司。分光光度儀為芬蘭雷勃公司產品 （Multiskan MS，Labsystems Oy，Helsinki， Finland）； 細胞培養箱 （美國熱電，3111型）。二甲基亞砜（DMSO，沈陽化學試劑廠）。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養 將HaCaT細胞培養于含10%小牛血清、100 U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM培養液中，37℃，5%CO2的細胞培養箱內培養。

1.3.2 CCK-8法檢測細胞增殖的試驗 將培養的HaCaT細胞，以5×104/孔接種于96孔板，每孔接種100 μL，培養液為含有10%小牛血清的DMEM，待細胞長至60%～70%融合狀態時，加以處理因素，根據預實驗結果分組為：60 μg/mL 蛇床子素處理組，40 μg/mL蛇床子素處理組，20 μg/mL蛇床子素處理組和正常對照組，每組均設6個平行孔，實驗均重復3次，常規培養48 h。各處理組待測樣品用DMSO溶解，用DMEM培養液稀釋，DMSO終體積分數≤0.1%，每組蛇床子素終質量濃度分別為60、40、20 μg/mL。正常對照組每孔加入與處理組等體積的DMEM培養液，培養48 h，各組加入CCK-8 10 μL，待培養液顯色后，用酶標儀測各孔450 nm波長的吸光度A值，以細胞的存活率表示細胞的增殖程度。細胞的存活率（%）=［（A1-A3）÷（A2-A3）］ × 100%。 A1：試驗組；A2：對照組；A3：只含有培養基和CCK-8的空白組。

1.3.3 細胞凋亡檢測 HaCaT細胞培養，分組同“1.3.1”項下方法。各組HaCaT細胞處理后，消化，洗滌，收集細胞，制備細胞懸液，冰浴避光中操作如下：采用結合緩沖液懸浮細胞，使其濃度為5×104/mL，后加入Annexin-FITC和PI，共同孵育15 min染色，1 h內，流式細胞儀檢測細胞凋亡水平。

1.3.4 Hoechst33258熒光法觀察細胞凋亡形態 取對數期細胞消化制備活細胞懸液，按每孔5×104/L接種于預先置入玻璃蓋玻片的6孔培養板中，每孔加細胞懸液2 mL，培養24 h，試驗分組和處理同“1.3.1”項下方法，孵育48 h后，吸盡培養液，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗2遍，每孔加入4%多聚甲醛溶液固定，PBS洗滌細胞，Hoechst 33258染色，于熒光顯微鏡下觀察細胞形態。

1.3.5 Western blotting檢測 實驗分組和處理同“1.3.1”項下方法，每個濃度均設6孔，培養48 h，收集培養后的HaCaT細胞，提取總蛋白，用BCA法蛋白定量，上樣，SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜，PBS洗膜，5%脫脂牛奶封閉1 h；PBS洗膜后加一抗，多克隆兔抗PI3K（1∶1 500，Cell Signaling Technology，Inc，#4255）； 多克隆兔抗 p-PI3K （tyr458，1∶1 000，Cell Signaling Technology，Inc，#4228S）；多克隆兔抗 AKT（1∶1 1000，Cell Signaling Technology，Inc，#9272）； 多克隆兔抗 p-AKT（ser473，1∶1 000，Cell Signaling Technology，Inc，#4060）；單克隆兔抗 Bcl-2（1∶1000，CellSignalingTechnology，Inc，#4223）；單克隆兔抗 Bax （1∶1 000，Cell Signaling Technology，Inc，#5023）， 單克隆兔抗 Cleaved-caspase3 （1∶1 000，Cell Signaling Technology，Inc，#9664），4 ℃ 過 夜 ；PBS洗膜，用辣根過氧化物酶標記的二抗（上海興悠生物科技有限公司）1∶5 000稀釋后孵育0.5 h；洗膜后用增強化學發光試劑盒檢測 （ECL，Amersham Biosciences公司）。結果掃描后，用Quantity one圖像分析軟件進行光密度分析，以 β-actin（Santa Cruz，1∶200）為內參校正。

1.4 統計學處理

應用SPSS22.0統計軟件。計量資料以（x±s）表示，兩個獨立樣本均數比較采用t檢驗，多組均數比較采用單因素方差分析，多個樣本均數的兩兩比較采用SNK-q法進行處理。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 不同質量濃度蛇床子素對HaCaT細胞增殖作用的影響

在所選質量濃度范圍內，蛇床子素對HaCaT細胞的增殖有抑制作用（圖1C）。不同質量濃度藥物處理組分別培養 48 h 后，60 μg/mL 組、40 μg/mL 組、20 μg/mL組與正常對照組比較，HaCaT細胞增殖有顯著差異（P＜0.05），且3個處理組組間比較，HaCaT細胞增殖也有顯著差異（P＜0.05）。以上結果表明蛇床子素能質量濃度依賴性地抑制HaCaT細胞增殖。

2.2 不同質量濃度蛇床子素對HaCaT細胞凋亡的影響

AnnexinV/PI雙 染 法 結 果 顯 示 ，60 μg/mL 組 、40 μg/mL 組、20 μg/mL 組HaCaT 細胞凋亡較正常對照組顯著增加（P＜0.05）；且3個處理組組間比較，Ha-CaT細胞凋亡也有顯著差異（P＜0.05）。由此可見，蛇床子素對HaCaT細胞凋亡有促進作用。見圖1A和1D。

2.3 各組HaCaT細胞凋亡形態比較

經Hoechst染色后，正常對照組中的HaCaT細胞大而飽滿，呈均勻藍色熒光；在不同質量濃度蛇床子素處理組中細胞核可見濃染致密的顆粒熒光，細胞縮小；隨蛇床子素質量濃度的增加，細胞出現典型的凋亡形態，高倍鏡下可觀察到細胞變小，胞核皺縮、碎裂，染色質濃縮，聚集在核膜邊緣，形成染色質邊集。見圖1B。

圖1 各組HaCaT細胞增殖和凋亡比較

2.4 不同質量濃度蛇床子素對HaCaT細胞凋亡相關蛋白 Bcl-2，Bax，Cleaved-caspase3 表達的影響

蛇床子素對HaCaT細胞抗凋亡蛋白Bcl-2的表達有抑制作用，對促凋亡蛋白Bax，Cleaved-caspase3的表達有促進作用（圖2A和2B）。與正常對照組比較，蛇床子素 60 μg/mL 組、40 μg/mL 組、20 μg/mL 組對HaCaT細胞Bcl-2表達有抑制作用（P＜0.05），且各處理組間對HaCaT細胞Bcl-2表達抑制作用有顯著性差異（均P＜0.05）。與正常對照組比較，蛇床子素60 μg/mL組、40 μg/mL 組、20 μg/mL 組對 HaCaT 細胞 Bax表達有促進作用 （P＜0.05），且各處理組間對HaCaT細胞Bax表達蛋白的促進作用有顯著差異（均P＜0.05）。與正常對照組比較， 蛇床子素 60 μg/mL組、40 μg/mL組、20 μg/mL組對HaCaT細胞Cleaved-caspase3表達有促進作用 （P＜0.05），且各處理組間對HaCaT細胞Cleaved-caspase3表達蛋白的促進作用有顯著性差異（均P＜0.05）。

圖2 不同質量濃度蛇床子素對HaCaT細胞PI3K-AKT通路及下游凋亡相關蛋白表達的影響

2.5 不同質量濃度蛇床子素對HaCaT細胞AKT，p-AKT，PI3K，p-PI3K 表達的影響

蛇床子素處理對 HaCaT細胞 AKT，PI3K蛋白表達無明顯影響，但對p-AKT，p-PI3K的表達有明顯抑制作用（圖2C和2D）。與正常對照組比較，蛇床子素60 μg/mL組、40 μg/mL 組、20 μg/mL 組對 HaCaT 細胞p-PI3K表達均有抑制作用（P＜0.05），且各處理組間對HaCaT細胞表達p-PI3K抑制作用有顯著性差異 （均P＜0.05）。與正常對照組比較，蛇床子素60 μg/mL組、40 μg/mL 組、20 μg/mL 組對 HaCaT 細胞 p-AKT 表達均有抑制作用（P＜0.05），且各處理組間對HaCaT細胞p-AKT表達抑制作用有顯著性差異（均P＜0.05）。與正常對照組比較，蛇床子素60 μg/mL組、40 μg/mL組、20 μg/mL組對HaCaT細胞AKT和PI3K蛋白表達無顯著性差異（均P＞0.05）。

3 討 論

角質形成細胞的過度增殖是尋常型銀屑病的主要病理特征之一。現代研究表明磷脂酰肌醇3激酶信號轉導通路即PI3K/AKT信號轉導通路是細胞存活的重要通路［7］，廣泛參與細胞增殖、細胞分化、細胞代謝和腫瘤侵襲等多個生物學過程，在維持細胞生長、增殖中發揮關鍵作用［8-10］。Akt是PI3K信號通路下游直接的靶蛋白，也稱為蛋白激酶B（PKB），是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶［11］，有研究發現，銀屑病皮損中PI3K基因及其亞單位PI3K蛋白的表達特異性增高［12］。也有研究表明銀屑病患者皮損內p-Akt的蛋白水平明顯高于正常皮膚［13］，Akt活性增強可引起角質細胞的過度增殖和真皮乳頭血管增生［14］。而且AKT的活化可以調控下游Bax、Bcl-2的表達和功能，從而抑制細胞凋亡，促進細胞增殖［15］。

在以前的研究中，蛇床子素能抑制部分腫瘤細胞的增殖［16］，前期研究也發現蛇床子素能抑制HaCaT細胞增殖［17］。但具體機制尚不清楚。在本研究中，筆者觀察了不同質量濃度蛇床子素對HaCaT細胞增殖和凋亡的影響，并對PI3K-AKT通路和相關的下游蛋白進行了檢測。結果表明，蛇床子素能抑制HaCaT細胞增殖和促進HaCaT細胞凋亡，此外，筆者還發現蛇床子素能抑制PI3K和AKT蛋白的磷酸化，并上調促凋亡蛋白Bax和Cleaved-caspase3的表達，下調抗凋亡蛋白Bcl-2的表達。根據上述結果，筆者認為蛇床子素可能通過抑制PI3K-AKT通路的活化，進而上調促凋亡蛋白的表達，下調抗凋亡蛋白的表達，抑制HaCaT細胞增殖和促進HaCaT細胞凋亡。盡管HaCaT細胞并不完全等同于銀屑病皮損區角質形成細胞，但是在銀屑病中，蛇床子素仍然有可能產生類似的效應。本研究為中藥蛇床子治療銀屑病提供了一定的依據。