黃芪甲苷改善大鼠急性腦梗死神經運動功能及對梗死側大腦皮層中NF-κB p65及IKKβ蛋白的影響*

付蓓蓓 鄭永強 徐 悅

［湖北省十堰市人民醫院（湖北醫藥學院附屬人民醫院），湖北 十堰 442000］

急性腦梗死是由于腦部血液供應突然中斷后導致腦組織缺血缺氧引起腦組織神經功能缺損的綜合征。本病在中老年人群高發，是致死和致殘的最主要原因，已排在我國死亡原因的第2位，致殘原因的第1位。每年腦梗死治療費用占到醫療健康預算的3%～7%［1-2］。隨著人口老齡化進程的加速，其病死率、致殘率和醫療花費都在增加。筆者在醫院神經內科的臨床工作中體會到，急性腦梗死的治療主要是改善患者的活動能力和生活質量。因此，改善神經運動功能是急性腦梗死的治療關鍵。現代藥理學研究發現，黃芪具有抗炎、抗氧化、免疫調節、保肝等多種藥用價值［3］。黃芪甲苷是黃芪的主要有效成分，通過抑制缺血區苯二氮 受體的表達，減少半暗區面積，從而發揮保護腦組織的作用［4］。在發生急性腦梗死時，繼發性顱內炎癥級聯反應是導致病情加重的一個重要因素［5］。 核轉錄因子-κB（NF-κB）信號通路是體內抗氧化系統中重要的通路，可調控下游的氧化應激和炎癥反應等相關基因的轉錄［6］。因此，本研究通過制備大鼠急性腦梗死模型，給予不同劑量的黃芪甲苷進行干預，探討黃芪甲苷改善大鼠急性腦梗死神經運動功能及其作用機制。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取雄性8周齡SD大鼠40只［由山東省醫學科學院實驗動物中心提供，許可證號SCXK（魯）2012-0002，動物合格證編號0001507］，體質量200～240 g，動物飼養在溫度22～24℃，相對濕度為40%～70%，噪音≤50 dB的SPF環境中，自由進食和飲水，控制飼養環境晝夜循環（12h/12h）。動物相關處置均符合《中華人民共和國實驗動物管理條例》要求，適應性喂養1周后進行實驗。

1.2 藥物與試劑 黃芪甲苷（純度98%，國藥準字Z51020664，產品批號0781200008，購于上海融禾醫藥科技發展有限公司）；3%戊巴比妥 （購于上海上藥新亞藥業有限公司）；羥甲基纖維素鈉（購于湖北遠成賽創科技有限公司）；三苯基四氮唑（TTC）（購于美國Biosharp公司）；鼠抗 NF-κB p65 和 IΚB 激酶 β（IKKβ）抗體（購于美國Cell Signaling Technology公司）；鼠抗GADPH單克隆抗體和辣根過氧化物酶HRP標記親和純化山羊抗鼠IgG二抗 （購于北京中杉金橋生物技術有限公司）；蛋白抽提試劑盒（購于武漢博士德生物工程有限公司）；ELISA試劑盒 （購于欣博盛生物科技有限公司）。因黃芪甲苷難溶于水，用0.5%羥甲基纖維素鈉溶液溶解，配制成質量濃度為80 mg/kg的黃芪甲苷應用液備用。

1.3 分組及造模 對SD大鼠進行編號，用隨機數字表法將SD大鼠均分為4組：假手術組、模型組、溶劑對照組和黃芪甲苷組。大鼠禁食12 h后用3%戊巴比妥（300 mg/kg）腹腔注射麻醉后，對頸部進行剃毛和消毒，使大鼠仰臥固定于手術臺上，沿頸正中線行手術切口，進行肌肉鈍性分離，充分暴露右側血管，分離頸總動脈、頸內動脈和頸外動脈，結扎頸外動脈，在距頸內和頸外動脈分叉處約4 mm剪開一個小口，將預先浸在肝素溶液中的尼龍魚線從開口插入頸內動脈20 mm，阻塞大腦血流［7］。用生理鹽水清洗切口后逐層縫合。假手術組只切開皮膚和分離血管，不阻塞血流。術后給予20萬U青霉素肌肉注射，連續使用3 d。黃芪甲苷組腹腔注射給予80 mg/kg的黃芪甲苷應用液，從術后第1日開始，持續給予14 d。假手術組和模型組給予等體積0.9%氯化鈉注射液，溶劑對照組給予等體積0.5%羥甲基纖維素鈉溶液。在第14日對大鼠神經運動功能評分后處死大鼠，分離腦組織進行相關檢測。

1.4 標本采集與檢測 1）TTC染色測定大鼠腦梗死體積。處死大鼠后取完整腦組織，每組3個腦組織置于冰箱中冷凍15 min，行冠狀位切片，厚度2 mm，置于2%的TTC染液中孵育30 min，用磷酸鹽緩沖液終止染色。用4%的甲醛固定2 h后拍照，用Image Pro Plus 6.0軟件計算梗死體積。2）神經運動功能評分。根據Bederson JB評分方法進行評分，采用雙盲法，于造模后1 d和14 d各評1次。3）ELISA法檢測梗死側大腦皮層中白細胞介素-1β（IL-1β）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）含量。取適量右側腦組織，制成勻漿，吸取上清進行實驗。根據ELISA試劑盒說明書進行IL-1β和TNF-α含量測定，在450 nm處測各孔吸光度（A）值。4）Western blotting法檢測梗死側大腦皮層組織中NF-κB p65和IKKβ蛋白水平。取適量右側腦組織，約50 mg，用預冷磷酸鹽緩沖液洗滌2次，按1∶9加入蛋白抽提試劑，用超聲進行破碎，裂解15 min后離心后取上清，進行蛋白含量測定后調整蛋白質量濃度至10 mg/mL，加入1/5體積的5×Buffer進行變性，-80℃保存。對標本進行電泳、切膠；孵育一抗、孵育二抗，用凝膠成像系統采集圖像并進行分析。

1.5 統計學處理 應用IBM SPSS19.0統計軟件。計量資料以（±s）表示，采用單因素方差分析進行判斷，組間兩兩比較用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各種大鼠腦梗死體積比較 見表1，圖1。假手術組未見梗死灶，其余各組均出現不同程度梗死。溶劑對照組與模型組比較，梗死體積無明顯減小，差異無統計學意義（P＞0.05）。與模型組和溶劑對照組比較，黃芪甲苷組梗死體積明顯減小，差異有統計學意義（P＜0.05）。

表1 各組大鼠腦梗死體積比較（%，±s）

表1 各組大鼠腦梗死體積比較（%，±s）

與模型組比較，*P＜0.05；與假手術組比較，△P＜0.05；與溶劑對照組比較，▲P＜0.05。 下同

組 別 n 大鼠腦梗死體積假手術組 3模型組 3溶劑對照組 3 0 25.13±5.06△24.90±4.93*黃芪甲苷組 313.85±3.64*▲

圖1 各種大鼠腦梗死體積比較

2.2 各組大鼠神經運動功能評分比較 見表2。造模后直至實驗結束，假手術組未見大鼠死亡，模型組、溶劑對照組和黃芪甲苷組大鼠分別死亡2只、3只和1只。造模后1 d，各組大鼠神經運動功能評分無顯著差異（P＞0.05）；14 d后，溶劑對照組與模型組比較，大鼠神經運動功能評分無明顯差異（P＞0.05）；與模型組和溶劑對照組比較，黃芪甲苷組大鼠神經運動功能評分明顯減小，差異有統計學意義（P＜0.05）。

表2 各組大鼠神經運動功能評分比較（分，±s）

表2 各組大鼠神經運動功能評分比較（分，±s）

組 別 n 1 d 14 d假手術組 10模型組 8溶劑對照組 7 0 0 2.93±0.36△ 2.26±0.29△2.90±0.42 2.35±0.36*黃芪甲苷組 92.85±0.44 1.48±0.20*▲

2.3 各組大鼠梗死側大腦皮層中IL-1β和TNF-α含量比較 見表3。與假手術組比較，各組梗死側大腦皮層中IL-1β和TNF-α含量均增高，差異具有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，溶劑對照組梗死側大腦皮層中IL-1β和TNF-α含量降低不顯著，差異無統計學意義（P＞0.05）；與模型組和溶劑對照組比較，黃芪甲苷組梗死側大腦皮層中IL-1β和TNF-α含量降低顯著，差異具有統計學意義（P＜0.05）。

表3 各組大鼠梗死側大腦皮層中IL-1β和TNF-α含量比較（ng/L，±s）

表3 各組大鼠梗死側大腦皮層中IL-1β和TNF-α含量比較（ng/L，±s）

組 別 n IL-1β TNF-α假手術組 7模型組 5溶劑對照組 4 23.94±5.57 146.82±12.37 75.79±10.30△ 394.52±46.62△71.03±8.82△ 373.40±47.49△黃芪甲苷組 632.74±4.16*△▲ 213.73±33.06*△▲

2.4 各組大鼠梗死側大腦皮層中NF-κB p65和IKKβ蛋白水平比較 見表4，圖2。與假手術組比較，各組梗死側大腦皮層中NF-κB p65和IKKβ蛋白水平均增高，差異具有統計學意義（P＜0.05）；與模型組和溶劑對照組比較，溶劑對照組梗死側大腦皮層中NF-κB p65和IKKβ蛋白水平降低不顯著，差異無統計學意義（P＞0.05）；與模型組和溶劑對照組比較，黃芪甲苷組梗死側大腦皮層中NF-κB p65和IKKβ蛋白水平降低顯著，差異具有統計學意義（P＜0.05）。

表4 各組大鼠梗死側大腦皮層中NF-κB p65和IKKβ蛋白水平比較（±s）

表4 各組大鼠梗死側大腦皮層中NF-κB p65和IKKβ蛋白水平比較（±s）

組 別 n NF-κB p65 IKKβ假手術組 7模型組 5溶劑對照組 4 0.16±0.02 0.12±0.03 0.74±0.09△ 0.61±0.08△0.79±0.12△ 0.64±0.07△黃芪甲苷組 60.37±0.06*△▲ 0.29±0.05*△▲

圖2 各組大鼠梗死側大腦皮層中NF-κB p65和IKKβ蛋白表達

3 討 論

目前，對急性腦梗死的治療原則是恢復梗死區腦組織的血液灌流，保護依然存活的腦組織，減輕繼發性的腦損傷。組織型凝血酶原激活物（tPA）是唯一通過食品藥品監督管理局（FDA）許可的治療急性腦梗死的藥物，但因其治療時間窗只有3 h，影響了臨床使用率［8］。溶栓后對腦組織的保護是急性腦梗死治療的核心，在腦缺血和再灌注后結構及功能破壞是引起腦梗死并發癥的重要原因。同時，抑制炎癥級聯反應能顯著降低其并發癥［9］。糖皮質激素類藥物是腦梗死后期腦保護治療的一線藥物，但其增加感染風險、消化系統潰瘍等副作用限制了其臨床應用［10］。同時，諸如心房肽、鈣調蛋白拮抗劑等目前開發的新藥尚未進入臨床［11-12］。《神農本草經》記載，黃芪有利水消腫、益氣理虛、扶正固本等功效。黃芪甲苷是衡量黃芪有效成分含量的一個重要的單體指標，其具有良好的有抗炎、抗氧化功能［13］。本研究結果顯示，給予黃芪甲苷后，大鼠腦梗死體積顯著減小、神經運動功能評分顯著下降，提示黃芪甲苷能減小急性腦梗死大鼠的梗死體積和改善神經運動功能。

炎癥反應的基礎是炎癥細胞和炎癥介質，最終由炎癥介質發揮作用。IL-1β是體內作用最強的炎癥因子，是TNF-α級聯反應的產物，TNF-α是炎癥后最早出現的細胞因子，當他們過度表達時介導炎癥因子趨化作用而加劇瀑布樣炎癥反應，最終導致組織損傷［14-15］。NF-κB通路參與了急性缺血性損傷的病理生理過程。其家族包含 RelA （p65）、NF-κBI、RelB、NF-κB2 和 c-Rel 5個成員，通過經典和非經典兩種途徑來發揮炎癥反應調控作用［16］。其中經典途徑主要與炎癥反應有關，依賴于 IKKβ 水平的變化［17］。 靜息狀態下，NF-κB 處于低表達水平，與NF-κB的抑制因子（I-κB）結合形成非活性的二聚體。當發生缺血損傷時，在炎癥介質 （如ICAM-1、TNF-α、IL-1β、IL-6、COX-2 等）的刺激下，通過細胞膜上的Toll樣受體4（TLR-4）特異性識別炎癥信號，使IKKβ表達水平增加，磷酸化I-κB并將其水解，識別 NF-κB p65，使 NF-κB p65 得到釋放，從細胞質向細胞核轉移，導致炎癥反應的級聯放大效應［18-19］。研究顯示，香芹酚能通過抑制炎癥介質（TNF-α和IL-1β）的表達來調控NF-κB p65和IKKβ的表達水平來發揮保護大鼠急性腦梗死后神經運動功能［20］。本研究結果與之相符。

綜上所述，黃芪甲苷能改善急性腦梗死大鼠的神經運動功能，在腦梗死早期給予黃芪甲苷，能顯著降低炎癥因子（IL-1β和TNF-α等）的表達水平，從而抑制NF-κB信號通路來達到改善腦梗死預后的目的。本研究對黃芪甲苷治療腦梗死患者預后提供了實驗依據，黃芪甲苷藥用價值的開發需進一步研究。