清腸溫中方通過miR-675-5p/VDR信號通路調控潰瘍性結腸炎Th17/Treg免疫平衡及腸黏膜屏障的機制研究*

孫中美 丁龐華 王文婷 史 瑞 裴文靜 郭 一 謝添弘 姜 慧 石 磊 原文靜 毛堂友 △ 指導 李軍祥

（1.北京中醫藥大學東方醫院，北京 100078；2.北京中醫藥大學，北京 100029；3.北京市羊坊店醫院，北京 100038；4.北京中醫藥大學東直門醫院，北京 100700）

潰瘍性結腸炎（UC）是炎癥性腸病的一種，主要表現為腹痛、腹瀉、黏液膿血便等，嚴重影響患者的生活質量［1］。目前UC的發病機制尚不清楚，最新研究顯示，miR-675-5p/維生素D受體（VDR）信號通路失調，造成腸黏膜屏障功能受損及腸黏膜免疫紊亂，是導致UC發病的主要機制之一［2］。本課題組前期研究發現，清腸溫中方能夠明顯改善UC患者的臨床癥狀，抑制炎癥反應，修復腸黏膜損傷，但具體機制不明［3］。因此，本研究將從miR-675-5p/VDR信號通路入手，進一步探討清腸溫中方治療UC的作用機制。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 24只健康SPF級SD雄性大鼠,體質量（180±220） g，購自斯貝福（北京）生物技術有限公司，許可證號：SCXK（京）2016-0002，飼養于北京中醫藥大學東方醫院動物房。12 h光照/黑夜循環，溫度20～24℃，濕度50%～60%；自由飲食飲水飼養。

1.2 藥物 清腸溫中方配方顆粒：黃連6 g，炮姜10 g，三七 6 g，青黛 6 g，地榆炭 15 g，苦參 15 g，木香 6 g，炙甘草6 g。由北京中醫藥大學東方醫院配方顆粒藥房統一購于北京康仁堂藥業有限公司。

1.3 試劑與儀器 葡聚糖硫酸鈉（MW36-50KDa；MP Biomedical，Burlingame，CA，USA），便潛血試紙（珠海貝索生物技術有限公司）；ZO-1抗體 （Santa cruz，SC-8146），Occludin 抗體（Abcam，Ab31721）。

1.4 分組、造模及標本采集 動物模型的建立方法如前期研究［4-5］，所有大鼠適應性飼養7 d后，稱取體質量，按照隨機數字表法將大鼠隨機等分為3組：空白組、模型組、清腸溫中方組。空白組自由飲用去離子水同時予去離子水灌胃；模型組和清腸溫中方組自由飲用4.5%DSS溶液制備UC模型，同時模型組給予去離子水，清腸溫中方組予清腸溫中方灌胃7 d。每日稱取大鼠體質量，觀察大便性狀，檢測便潛血，計算疾病活動指數。干預結束后，禁食不禁水24 h后麻醉大鼠，取血及結腸組織，-80℃凍存備用。

1.5 結腸miR-675-5p表達檢測 按照TRIzol Regent說明書提取RNA。miR-675-5p的逆轉錄引物為5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTG GATACGACCAGTGTGC-3′。逆轉錄條件為42℃，60min，72℃5 min。逆轉錄獲得的cDNA進行實時熒光定量PCR檢測miR-675-5p的表達，以U6作為內參，引物序列見表1，采用2-△△CT法進行數據的相對定量分析。

表1 miR-675-5p及U6基因序列引物

1.6 結腸 VDR mRNA、孤核受體（RORγt） mRNA、叉頭蛋白P3（Foxp3）mRNA的表達檢測 提取結腸組織樣本的總RNA，逆轉錄后進行PCR擴增，PCR產物經電泳后， 采用 2-△△CT法進行 VDR mRNA、RORγt mRNA、Foxp3 mRNA的相對定量分析。VDR mRNA、RORγt mRNA、Foxp3 mRNA 的引物如表2。

表 2 VDR、RORγt、Foxp3 基因序列引物

1.7 ELISA檢測血清白細胞介素-10（IL-10）、白細胞介素-17（IL-17）的表達 應用大鼠IL-10、IL-17酶聯免疫試劑盒檢測大鼠血清IL-10、IL-17的濃度。

1.8 免疫組織化學檢測結腸ZO-1、Occludin的表達4 μm厚石蠟切片經過脫蠟、復水、高壓修復、封閉后，加入一抗（ZO-1抗體濃度1∶500，Occludin抗體濃度1∶500）、二抗，經過顯色、復染、脫水、封片后，200 倍鏡視野下采集圖片，Image pro plus 6.0軟件分析圖像，計算光密度和染色區域總面積，用平均光密度（IOD/area）來進行統計分析。

1.9 統計學處理 應用SPSS17.0統計軟件。計量資料以（±s）表示，符合正態分布且方差齊進行單因素方差分析（One-way ANOVA），不符合正態分布或方差不齊進行非參數檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠結腸miR-675-5p、VDR mRNA的比較見表3。空白組第8號大鼠在實驗第3天不明原因死亡，其余大鼠均耐受實驗干預措施，直至實驗結束。模型組大鼠結腸組織miR-675-5p的表達水平顯著升高（P＜0.01），VDR mRNA 的表達水平顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，清腸溫中方組大鼠結腸組織miR-675-5p的表達水平顯著降低 （P＜0.05），VDR mRNA的表達水平顯著升高（P＜0.05）。

表3 各組大鼠結腸miR-675-5p、VDR mRNA的比較（±s）

表3 各組大鼠結腸miR-675-5p、VDR mRNA的比較（±s）

與空白組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。下同

組別 n miR-675-5p VDR mRNA空白組 7 1.762±0.577 4.173±1.600模型組 8 3.182±0.907△△ 2.570±0.924△清腸溫中方組 8 1.832±0.853* 3.973±1.217*

2.2 各組大鼠結腸 RORγt mRNA、Foxp3 mRNA的比較 見表4。與空白組比較，模型組大鼠結腸組織RORγt mRNA的表達水平明顯增高 （P＜0.05），而Foxp3 mRNA的表達水平顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，清腸溫中方組大鼠結腸的RORγt mRNA的表達水平明顯降低（P＜0.05），而Foxp3 mRNA的表達水平顯著升高（P＜0.01）。

表4 各組大鼠結腸RORγt mRNA、Foxp3 mRNA的比較（±s）

表4 各組大鼠結腸RORγt mRNA、Foxp3 mRNA的比較（±s）

組 別 n RORγt mRNA Foxp3 mRNA空白組 7 1.122±0.387 1.216±0.563模型組 8 1.756±0.415△ 0.592±0.210△清腸溫中方組 8 1.150±0.306* 1.434±0.496**

2.3 各組大鼠血清IL-10、IL-17的比較 見表5。與空白組比較，模型組大鼠血清IL-10明顯降低 （P＜0.01），而血清IL-17明顯升高（P＜0.05）。清腸溫中方干預后，血清IL-10明顯升高（P＜0.05），而血清IL-17明顯降低（P＜0.05）。

表5 各組大鼠結腸血清IL-10、IL-17的比較（pg/mL，±s）

表5 各組大鼠結腸血清IL-10、IL-17的比較（pg/mL，±s）

組 別 n IL-10 IL-17空白組 7 73.39±14.35 3.93±0.41模型組 8 43.90±8.91△△ 6.16±1.71△清腸溫中方組 8 62.30±13.79* 4.14±0.20*

2.4 各組大鼠結腸ZO-1、Occludin的比較 空白組大鼠結腸組織中的ZO-1、Occludin陽性表達較多，模型組中ZO-1、Occludin陽性表達區域明顯減少，經過治療后，清腸溫中方組較模型組的表達相對增強，其組織切片陽性表達染色主要為深棕黃色或褐色，見圖1、圖2。與空白組比較，模型組ZO-1、Occludin的平均光密度明顯降低（P＜0.05）；清腸溫中方治療后，大鼠結腸的ZO-1、Occludin平均光密度較模型組顯著增加（P＜0.05或P＜0.01），見表 6。

表6 各組大鼠結腸ZO-1、Occludin的比較（±s）

表6 各組大鼠結腸ZO-1、Occludin的比較（±s）

組 別 n ZO-1平均光密度 Occludin平均光密度空白組 7 0.127±0.038 0.119±0.043模型組 8 0.076±0.044△ 0.082±0.023△清腸溫中方組 8 0.117±0.019* 0.117±0.014**

3 討 論

圖1 各組大鼠結腸ZO-1蛋白表達情況（IHC，200倍）

圖2 各組大鼠結腸Occludin蛋白表達情況（IHC，200倍）

UC是一種病變局限于黏膜及黏膜下層的結腸及直腸的慢性非特異性炎癥性疾病，典型的臨床癥狀為黏液膿血便，其病因尚不明確［6］。本病病程較長，在身體、心理以及經濟方面均對患者造成巨大的壓力［7］。目前，UC的主要治療目的是誘導緩解、維持緩解以及防止復發等方面。西醫主要的治療方法有氨基水楊酸制劑、糖皮質激素、免疫抑制劑、微生物制劑以及生物制劑等，但是在臨床使用中存在各種問題，如氨基水楊酸制劑存在藥物不良反應明顯、療程長等缺點；糖皮質激素易導致機會性感染及骨折風險升高，且存在藥物依賴及藥物抵抗的問題；而免疫抑制劑以及生物制劑使用過后感染及腫瘤發生的風險升高，且其目前尚在研究階段，療效及安全性尚不明確［8-11］。中醫藥辨證論治在UC的治療中因效果顯著、副作用小等優勢取得了令人矚目的成就。

清腸溫中方是本文指導，北京中醫藥大學東方醫院李軍祥教授根據多年治療UC總結的經驗方，主要組成為：黃連 6 g，炮姜 10 g，青黛 6 g，苦參 15 g，三七6 g，木香 6 g，地榆炭 15 g，炙甘草 6 g。本方以黃連、炮姜為君藥以清熱燥濕，溫脾止瀉；三七、苦參、青黛為臣藥以增強清熱燥濕之功，并兼化瘀止血之效；以木香、地榆炭為佐藥以行氣導滯、涼血止血；并以炙甘草為使藥以補益脾氣、調和諸藥。前期臨床、動物實驗［3-5］提示清腸溫中方治療UC療效顯著，并抑制腸道炎癥反應修復腸黏膜損傷，但具體機制不明。本實驗通過研究清腸溫中方對DSS誘導UC大鼠Th17/Treg免疫平衡及腸黏膜屏障的影響，進一步探究其治療UC的機制。

MiR-675-5p是長鏈非編碼 RNA（lncRNA）H19的直接轉錄產物，由LncRNA H19第一外顯子區編碼生成的。LncRNA H19的高表達可以增加miR-675-5p的釋放量，而miR-675-5p可以通過和下游靶基因VDR mRNA的3’UTR以非完全匹配方式相結合，從而干擾和抑制VDR mRNA的翻譯，同時還可以通過使靶基因VDR mRNA脫腺苷酸化的作用，增強其對靶基因VDR mRNA的降解，從而降低VDR的表達［12-13］。

VDR是類固醇激素/甲狀腺激素受體超家族的一員，是一類配體依賴性的轉錄因子，在人體中廣泛表達于各類細胞。VDR一方面可特異性地與維生素D（VD）結合，調節其內生維生素D的活化形式，即維生素D-1，25（OH）2D3的水平，改變上皮通透性，促進腸黏膜屏障緊密連接蛋白ZO-1、Occludin等和黏附連接蛋白E-cadherin的表達，從而增強腸壁的屏障功能；另一方面表達于CD4+T細胞上的VDR與VD特異性結合后，從而調控Th17/Treg免疫平衡，從而維持腸黏膜免疫穩態［14-16］。

Th17/Treg免疫平衡的失調是UC發病的主要因素［17］。RORγt是促進Th17細胞分化的特異性轉錄因子，可誘導Th17細胞分泌IL-17等促炎因子，從而促進腸道炎癥；Foxp3是Treg細胞的特性核轉錄因子，可調節Treg細胞的分化發育，誘導IL-10等抑炎因子的產生，二者保持動態平衡，共同維持腸黏膜免疫穩態［18-19］。當二者的免疫平衡失調后，會導致Th17細胞分泌的IL-17等促炎因子的分泌增多，Treg細胞分泌的IL-10等抑炎因子的數量減少，最終引起腸黏膜免疫紊亂，導致UC 發生［20-21］。

因此，通過調控miR-675-5p/VDR信號通路修復UC大鼠腸黏膜屏障及調控Th17/Treg免疫平衡成為治療UC的新的方向。本次研究發現，模型組大鼠結腸miR-675-5p、RORγt mRNA 及血清 IL-17的表達較空白組明顯增高，VDR mRNA、Foxp3 mRNA、ZO-1、Occludin、血清IL-10的表達較空白組明顯降低，提示miR-675-5p/VDR信號通路參與了UC的發病過程，而經過清腸溫中方的干預后，大鼠結腸miR-675-5p、RORγt mRNA及血清IL-17的表達較模型組明顯降低， 而 VDR mRNA、Foxp3 mRNA、ZO-1、Occludin、血清IL-10的表達較模型組明顯升高，表明清腸溫中方可以通過降低miR-675-5p的表達，靶向調控VDR信號通路，從而調控UC Th17/Treg免疫平衡、修復腸黏膜屏障損傷，達到治療UC的目的。

本次研究通過動物實驗探討了miR-675-5p/VDR信號通路促進大鼠UC發病的分子機制，對清腸溫中方治療UC的作用機制做了進一步探討，但中藥治療疾病的機制往往是多方面的，更深、更廣的作用機制有待于更深層次的研究。