基于動物福利的雌性生殖發育毒性體外培養技術研究進展

陸 琴， 周躍華， 唐海飛， 王智文， 張 婷

(1. 上海交通大學醫學院附屬同仁醫院， 上海 200336；2. 上海市計劃生育科學研究所， 國家人口和計劃生育委員會計劃生育藥具重點實驗室， 上海生殖健康藥具工程技術研究中心， 上海 200032；3. 上海應用技術大學生物工程系，上海 201418）

生殖發育毒性是指外源物質在動物繁殖周期的任何一個階段中所產生的毒副作用，既包括外源物質對親代生殖功能的影響，也包括對子代發育過程的有害影響。我國列入各類商品(藥品、食品、化學品和化妝品)毒性檢測指南的標準方法均來源于國際經濟合作與發展組織(The Organization for Economic Co-operation and Development，OECD)或者人用藥品注冊技術要求國際協調會(International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use， ICH)[1-2]。傳統的生殖發育毒性檢測以動物試驗為主， 包括分娩前發育毒性研究(OECD TG 414)、一代動物毒性研究(OECD TG 415)、二代動物毒性研究(OECD TG 416)、生殖毒性/發育毒性篩選檢測(OECD TG 421)、重復劑量毒性研究結合生殖毒性/發育毒性篩選檢測(OECD TG 422)， 以及2009 年發布的Hershberger 實驗(TG 411)和討論中的發育神經毒性試驗(TG 426)[3-5]。完整的生殖發育毒性研究包括成年動物從受孕到子代性成熟的各個發育階段接觸受試物的反應。化學物的生殖發育毒性有2個顯著的特點： ①生殖系統較機體的其他系統對化學物的毒性作用更為敏感； ②損害作用不僅影響接觸化學物質的母體本身，還可影響其后代。鑒于哺乳類動物繁殖過程的復雜性，因此需要對繁殖過程的各個方面進行毒理學分析，包括致畸性、內分泌干擾、母細胞突變、生育受損等[6]。2011 年7 月28 日OECD 提出了一項試驗指南， 稱為延長一代生殖發育毒性研究(OE CD TG443)， 用于替代一代和二代動物毒性研究(OECD TG 415 和416)[7]，這項指南將動物福利等因素考慮進去，最大程度減少了實驗動物的使用[8]。

目前全世界每年用于實驗的動物數以千萬計，實驗嚙齒類、實驗兔、犬、豬、牛、羊及非人靈長類動物等被廣泛用于科學實驗，引發動物保護組織的持續關注。促進3R，即減少(Reduction)、替代(Replacement)、優化(Refinement)理論發展，是實驗動物使用者的責任[9]。毒理學替代方法指能替代動物實驗、減少所需動物數量或使動物實驗程序得以優化而減少動物痛苦的任何方法或程序。其范圍主要包括用組織學、胚胎學、細胞學或計算機等方法取代整體動物實驗，或以低等動物取代高等級動物等。生殖和發育毒性檢測中使用的動物數量較多， 但因哺乳動物生殖周期的復雜性， 生殖發育毒性替代方法的研究一直在進行中[10]。已有3 種體外模型，全胚胎培養試驗(whole embryo culture test，WEC)、微團檢測法(micromass test，MM)[11]和胚胎干細胞試驗(embryonic stem cell test，EST)[12]于2003 年正式通過歐洲替代方法驗證中心(European Centre for the Validation of Alternative Methods， ECVAM)驗證， 并作為胚胎發育毒性的篩選方法[13]。生殖發育毒性體外替代優化方法的研究思路是將整個繁殖過程分成數個連續的生物學部分，分別對其進行單獨或聯合研究，最大程度地鑒定出外源毒性物質的靶器官或組織。目前，已經探索出一些很有前景的體外模型和方法，本文重點介紹雌性生殖發育毒性研究中體外培養技術研究進展。

1 雌性生殖系統組織和細胞培養

1.1 卵巢顆粒細胞培養

1.1.1 原代卵巢顆粒細胞培養 采用成年雌性大、小鼠動情周期的竇狀卵泡或21～30日齡幼年大鼠經注射孕馬血清(pregnant mare serum gonadotropin，PMSG)或埋置已烯雌酚作72～96 h 預處理后的卵巢，體外分離和加入刺激因子培養顆粒細胞。加入外源物質和細胞相互作用，隨后檢測細胞存活率和測定細胞分泌產物(雌二醇和孕酮)含量以評價顆粒細胞的功能狀態。該體外模型可以用來初步篩選影響顆粒細胞生長和發育的外源物質，缺陷是只能研究顆粒細胞的單一功能，不能研究對卵母細胞及其與卵泡膜細胞之間的相互作用，不能動態觀察卵泡形成過程和配子發生[14，15]。

1.1.2 永生化的顆粒細胞甾體生成試驗 在化妝品生殖和發育毒性檢測方法中選用永生化的小鼠顆粒細胞系NT-1和變異株NT-1-hAROM(表達人芳香化酶基因)，研究外源物質對顆粒細胞甾體生成水平的影響。如檢測對孕酮生成的影響，可將NT-1 細胞與不同濃度受試物孵育，免疫法測定上清液中孕酮含量，貼壁細胞采用MTT 法或者CCK-8 法進行細胞活性測試。如檢測對雌二醇生成的影響，可將NT-1-hAROM細胞與芳香化酶的底物雄烯二酮共孵育，酶聯免疫法測定培養液中的雌二醇的產量，貼壁細胞可以檢測細胞增殖情況[16，17]。

1.2 卵巢黃體細胞培養

采用妊娠16 d大鼠的黃體或25～30日齡幼年雌性大鼠促排卵后的妊娠黃體，在體外用不同的分離液和消化液分離出黃體細胞，制成懸液在體外培養。加入外源物質和細胞相互作用，觀察細胞存活率和測定細胞分泌產物孕酮含量，觀察細胞形態學，測定環磷酸腺苷、DNA 或蛋白質含量、激素受體等[18，19]。該方法可以用來初步篩選影響黃體細胞生長和發育的外源物質，和大鼠卵巢顆粒細胞培養方法類似，缺陷是黃體細胞原代培養比顆粒細胞培養困難，培養時間也較短。

1.3 腔前卵泡培養

大、小鼠腔前卵泡的發育過程中， 其組成部分在各個發育階段都有可能對外源物質的損傷敏感， 這些將影響卵泡的發育， 還可能引起卵母細胞減數分裂異常、受精失敗或者胚胎發育不良。通過卵泡形態學、生物功能和卵子的發生來檢測外源物質對其影響， 用于對卵巢功能有抑制作用或激活作用的外源物質的篩查， 也可用于外源物質對卵泡發育和受精能力的作用機制研究。卵泡培養方法目前主要有二維培養(貼壁卵泡培養)和完整三維結構(球狀結構)培養兩種類型。方法是從12～14 日齡的雌性大、小鼠卵巢中機械性分離腔前卵泡(120～170 μm)進行體外培養， 檢測指標主要是： 卵泡的存活、卵泡的生長、卵丘細胞-卵母細胞復合體(COCs)的排出比率、卵母細胞的數量和成熟度-生發泡(germinal vesicle，GV)、生發泡破裂(germinal vesicle breakdown， GVBD)和第一極體(polar body， PB)的形成率、性激素的水平如雄烯二酮、睪酮、雌二醇和孕酮水平[20-22]。

1.4 卵巢器官培養

取大、小鼠胚胎卵巢或出生后大、小鼠卵巢器官進行培養，也可對卵巢通過未損傷的脈管系統進行培養基灌流培養，主要用于卵巢內血流作用、靜止期卵泡的啟動、卵泡生長發育、排卵和卵泡獲得產生類固醇激素能力的研究[23]。缺陷在于體外培養時間短，不利于長期培養。

1.4.1 卵巢灌流培養系統 卵巢體外灌流培養是將手術分離后的卵巢放置于循環灌流系統中灌流培養，灌流系統內添加不同培養基，通過未損傷的脈管系統進行灌流，觀察培養后卵巢組織的生長并進行生物化學分析，也可檢測卵泡發育、排卵和類固醇激素的合成。主要用于研究外源物質對卵巢內卵泡發育和排卵的影響，便于從整體水平上發現毒性靶點。以妊娠13 d 小鼠胚胎卵巢為研究材料，建立小鼠胚胎卵巢器官體外無血清培養模型。胚胎卵巢培養分兩步： 首先在體積分數2%胎牛血清條件下胚胎卵巢進行貼壁培養5 d， 再以胰島素硒添加劑(insulin transferring selenium， ITS)和胎球蛋白繼續培養14 d(相當于到產后13 d)，經過19 d 的培養胚胎卵巢中有大量原始卵母細胞開始生長， 培養中后期胚胎卵巢中出現許多早期次級卵泡。新生嚙齒動物卵巢培養涉及從初生到出生20 d 的整個卵巢培養，多數的卵巢在體外培養8 d后， 將卵丘復合體分離再培養14 d。這種培養體系可用于毒理學研究，找出可能干擾這些進程的潛在危險的外源物質[24]。

1.4.2 卵巢皮質薄片培養 卵巢組織切片懸浮培養，增加了氣體和營養物質的擴散，減少卵巢組織的壞死[25，26]。通過組織切碎機將卵巢皮質層切成100 μm厚的薄片置于培養液中培養，組織培養到一定階段后再從薄片中分離腔前卵泡，進一步在體外發育為可以排卵、受精的卵母細胞。如有研究[27]將成年人的卵巢切片在體外與環磷酰胺、順鉑等化療藥物以及促性腺激素釋放激素激動劑共培養，表明促性腺激素釋放激素激動劑對于化療藥物引起的卵巢損失并無保護作用。還有研究[28，29]將妊娠12.5 d 小鼠胚胎時期卵巢(除去中腎)切片在體外培養28 d天用于分離卵母細胞做分析或切片在體外培養8 d，用于觀察生殖細胞密度。目前已證明，利用器官培養或皮質薄片培養能夠成功地在體外啟動原始卵泡的生長，它既保留了卵巢整個器官培養時的優點，又克服了其缺點，它可以去除卵巢髓質分泌的抑制因子對卵母細胞在體發育的抑制作用，從而在體外同時獲得大量發育程度相近的卵母細胞。該方法可以探究在體內很難評估的一些細胞因子對卵泡發育的影響，也可以研究卵巢在體外的類固醇激素合成能力及其影響因素。卵巢皮質薄片培養技術是卵巢器官培養的一個有力補充。

1.5 芳香化酶測試

芳香化酶在卵巢和胎盤中活性很高，具有將雄性激素轉化為雌性激素的功能，不少殺蟲劑、黃體類似物和芳香化酶抑制劑都有抑制芳香化酶的活性。體外芳香化酶檢測通過測量芳香化酶對標記的雄烯二酮的代謝能力，用于篩選外源物質是否干擾芳香化酶的活性。目前有兩種體外檢測系統，分別是JEG-3 和JAR 絨毛癌細胞系[30-32]。此外，還可以運用人類胎盤微粒體的體外亞細胞手段檢測芳香化酶的活性。

1.6 雌激素受體結合試驗

許多環境化合物雖然對人體不具有明顯毒性，但卻能干擾人的內分泌系統。這種內分泌干擾能夠破壞幾乎所有的脊椎動物的內分泌系統。雌激素主要通過雌激素受體(estrogen receptors， ERs)來介導細胞增殖、分化和內穩態的生物學作用。不同靶組織中的細胞質膜、線粒體、細胞核上的ERs 有著相似的調節功能， 但也存在一定的差異[33]。雌激素受體結合試驗用于檢測能夠與雌二醇受體結合的外源物質。通過定量檢測外源物質和17β-雌二醇與ERs的競爭性結合能力， 檢測受試物是否能與ERs結合發揮雌激素作用或干擾正常雌激素活性[34]。如應用雌激素競爭性受體結合試驗檢測樂果、乙酰甲胺磷、久效磷、馬拉硫磷、對硫磷和對氧磷6 種有機磷農藥的雌激素樣活性，結果顯示這6 種有機磷農藥的結合率均未下降到50%，說明這6 種有機磷農藥不與大鼠子宮雌激素受體的位點結合[35]。

1.7 雌二醇受體轉錄檢測

當外源物質干擾內分泌系統時可能會引起發育異常、生育障礙、患癌風險增加、免疫系統及神經系統功能異常等后果，其中最常受到影響的是性激素水平。雌二醇受體是一個誘導靶基因轉錄的轉錄因子，將雌二醇受體調控的DNA 序列與易測的報告基因連接，可以直接對雌激素類外源物質進行篩選。體外雌二醇受體轉錄檢測主要用于鑒定在體內能夠影響雌二醇活性的激動劑或拮抗劑。如293T、HSC-T6、MCF-7 等細胞均可被轉染成為檢測細胞[36-38]。OECD 建議使用來自人的宮頸癌并經穩定轉染的細胞系hERa-Hela-9903，細胞暴露于非細胞毒性濃度的受試物20～24 h 以誘發報告基因的產生，同時檢測4 種性激素水平，包括強雌激素(17β- 雌二醇）、弱雌激素(17β- 雌二醇)、極弱雌激素(17-β-甲基睪酮)和陰性對照(皮質甾酮)。如果誘發的最高反應相當于或者超過陽性對照(1 nmol/L 17-β-雌二醇)反應的10%， 可以判定為陽性物質(Test No.455)[39]。

1.8 子宮頸/內膜上皮細胞體外試驗

在基質中培養子宮頸/內膜上皮細胞，模擬體內環境，觀察細胞的形態學變化[40，41]，用CCK-8法和基因表達技術研究外源物質對子宮頸/內膜上皮細胞增殖和分化的影響[42]。類性激素外源物質會使子宮頸/內膜上皮細胞產生與內源性類固醇相似的反應，調節其功能。

2 胚胎組織和細胞培養

1990年代末， ECVAM推薦有效性較高的3個體外胚胎發育毒性篩選試驗作為體外篩選外源毒性物質的首選方法，即體外全胚胎培養試驗(WEC)、胚胎細胞微團培養試驗(MM)和胚胎干細胞試驗(EST)[11]。根據體內發育毒性的數據，將外源物質分為3 類： 無胚胎毒性、弱胚胎毒性和強胚胎毒性。試驗系統通過建立標準操作規程來達到標準化，結果顯示出良好的預測能力和重現性[43]。

2.1 WEC

胚胎毒性通常是指外源物質對胚胎選擇性毒性作用，表現為妊娠著床前早期階段或著床后階段胚胎的丟失，或出生前引發的在胎兒期觀察到的任何毒性表現。胚胎毒性雖然是在宮內引發，但表現在出生前或出生后發育過程中，主要包括妊娠卵枯萎、胎死宮內、胎兒生長受限、功能缺陷和畸形等。體外試驗具有簡便、經濟、試驗周期短、試驗條件可控、劑量-反應關系易測和排除母體干擾等優點，已廣泛應用于胚胎毒性的篩選和致畸機制的研究。體外全胚胎培養方法在致畸因素的篩選、致畸作用機制的探討及發育生物學等研究中均有廣泛的應用價值，是一種將動物的完整胚胎移植到體外進行培養的實驗技術。該方法1 9 3 0 年代由Nicholas 等[44]提出， 1970 年代由New 等[45]通過不斷改進發展成熟和完善，該法主要模型動物有小鼠、大鼠和兔等。大鼠全胚胎培養是從妊娠9～10 d 大鼠子宮取出胚胎，剝去胎膜，放入培養液中加入受試物，在含O2、CO2和N2環境中旋轉培養，觀察胚胎發育情況，記錄胚胎存活，檢測胚芽、卵黃囊直徑、體節和體長等情況。以胚胎的心跳和血液循環是否作為胚胎存活的指標； 以卵黃囊直徑、顱臀長和頭長、體節數和胚胎重作為配套生長發育的指標； 根據Brown 評分對器官形態分化作出評價，包括17 項形態指標： 卵黃囊血管、尿囊、胚胎體位、心臟、前后神經管、前腦、中腦、后腦、聽覺系統、視覺系統、嗅覺系統、鰓弓、上頜突、前肢芽、后肢芽和體節數。然后按各個組織器官形態分化過程分為5 個層次，分別賦予0～4 分，各組織器官累積得分為總得分。總得分越低，說明胚胎形態發育越不正常，即受試物的發育毒性作用程度越高[46]。該方法可用于篩查外源物質的發育毒性、探討其劑量反應關系和作用機制。用帶臟層卵黃囊的妊娠10.5 d 的兔胚胎在含100%氧氣密封瓶中體外旋轉培養，存活12 h； 用妊娠10 d 的日本大耳白兔胚胎在體外培養了48 h，形成了兔著床后全胚胎培養方法，評估體系與大鼠全胚胎培養方法類似[47]。

2.2 MM

微團培養是1980 年代由Flint[48]建立，并經Renault 等[49]加以改善的體外培養試驗系統，已廣泛應用于胚胎毒物篩檢。其理論基礎是： 一些毒性物質影響靶器官或靶組織細胞的分化、增殖、遷移及基質的改變，而這些改變可通過未分化細胞的體外培養表現出來，從而根據培養細胞集落形成數量、細胞形態、基質變化和超微結構的變化評價化學物質的毒性作用及其機制[11]。胚胎肢芽細胞可取自雞、兔或大、小鼠，細胞一般分離自器官形成中期胚胎的肢體或頭部組織，制成單細胞懸液后，以高密度接種培養，通過分析外源物質暴露后細胞分化情況，對確定的毒理學終點進行檢測。采用微團培養觀察不同濃度的雙酚A(0～50 mg/L)對體外培養的Wistar大鼠胚胎肢芽細胞增殖和分化的影響，結果顯示雙酚A對體外培養的Wistar大鼠胚胎肢芽細胞的增殖和分化均有抑制作用，表現為染毒組肢芽細胞集落形成數量減少，細胞毒性試驗吸光度值下降， 并呈現出明顯的劑量-反應關系[50]。采用妊娠13 d 小鼠胚胎后肢芽制成細胞懸液， 微團培養檢測續斷水煎液對小鼠胚胎肢芽細胞增殖，分化和凋亡的影響，結果表明續斷水煎液對胚胎肢芽細胞無毒性作用， 還能促進肢芽細胞的增殖和分化，抑制肢芽細胞的凋亡[51]。采用三維技術建立小鼠胚胎中腦體外培養系統， 在2個小鼠品系中進行驗證微團培養。從妊娠11 d 的C57BL/6 小鼠胚胎或妊娠12 d 的A/J 小鼠胚胎中分離腦細胞培養，高密度微團體外培養22 d 進行比較， 兩種小鼠微團系統的蛋白表達模式相似。這種研究早期神經發生的3D 培養方法，可應用于體外神經發育毒性的研究[11]。

2.3 EST

外源物質對于生殖細胞或者早期胚胎的影響將會引起不孕或者種植前胚胎的發育異常，進而引起胚胎毒性或者是后代的畸形，胚胎干細胞(ES)由于其無限增殖及多向分化的潛能而作為研究體外胚胎毒性的細胞模型得到廣泛應用，以ES 為基礎的EST是2003年獲得ECVAM認可的胚胎毒性評價的體外替代方法，但該實驗方法的快速性和準確性存在一定局限性，目前該細胞模型的研究主要集中于快速性和準確性的優化[12]。方法參照ECVAM 提供的EST 操作程序，采用小鼠ES E14TG2a 和成纖維細胞3T3 細胞，或者分別以小鼠ES、人ES(hES)、人誘導多能干細胞為試驗載體(hiPS)篩選外源物質對其影響[52-53]。

3 乳腺上皮細胞體外試驗方法

乳腺最主要的功能就是泌乳，乳腺上皮細胞是乳腺中唯一具有分泌功能的細胞。體外培養的乳腺上皮細胞在研究乳腺的發育機制、乳汁的分泌機制、乳腺生物反應器的構建和乳腺癌發生的研究中均有應用。與乳腺發育及泌乳相關的激素有三類。第一類是性激素： 包括雌激素、孕激素、催乳素和催產素； 第二類是與新陳代謝有關的激素： 包括生長激素、類固醇激素、甲狀腺激素和胰島素； 第三類是乳腺激素： 泌乳刺激素、甲狀旁腺激素相關肽和瘦素。雌激素和孕酮可以刺激單層小鼠乳腺上皮細胞酪蛋白的合成，單獨用雌激素可以促進小鼠乳腺合成酪蛋白及乳糖[54，55]。乳腺上皮細胞可取自兔、大鼠、小鼠、牛和人[56，57]。外源毒性物質與乳腺上皮細胞共孵育，觀察對其生長增殖和相關蛋白的影響，通過該方法也容易找到相應的保護物質，如茶多酚可保護牛乳腺上皮細胞免受過氧化氫誘導的氧化損傷[57]。

4 展望

現行完整的生殖發育毒性研究，包括二代生殖毒性在內，大約需要5 000 多只動物。整體動物雌性生殖發育毒性研究方法仍是評價外源毒性物質的主要方法，特別是藥物生殖發育毒性評估，但其存在不敏感、周期長、所需受試樣品量多，特別是由于體內實驗生殖功能主要是以與生殖后果有關的參數作為基礎，因此難以揭示毒作用位點和毒作用機制。而且，成年動物雌性卵巢是由不同發育階段各種卵泡群組成的，體內試驗不易發現不同階段的卵泡毒性。而雌性生殖發育毒性體外培養技術可以模擬生殖發育過程中的各個環節，對于優化和減少體內生殖毒性研究中動物的使用顯示出巨大潛力，并且便于精準確定毒性靶器官和探索毒性機制。但體外試驗也存在代謝能力和人體有差異、缺乏毒代動力學過程、種屬外推、體細胞與生殖細胞敏感度不同等問題。任何一種體外方法無法全面模擬外源物質在體內對生殖發育系統影響的全過程，尚不能完全替代目前生殖發育毒性試驗常用的整體動物實驗。現代生殖發育毒理學研究不斷引入新的體外培養技術，由傳統的整體動物實驗逐步發展到體外細胞和分子水平。三維培養系統的建立使相關培養方式更接近機體本身[58，59]，隨著各個替代優化方法不斷被驗證實施，雌性生殖發育毒性體外方法學研究將得到新的發展和突破。