Box-Behnken模型響應面法優化口蘑酸奶發酵工藝

楊帆，李楓，楊凱瑜

（福州大學至誠學院，福州350002）

0 引言

食用菌營養豐富已成為人類的第三大食物來源，并起到較好的食療功效被廣泛應用到食品行業中[1-3]。口蘑（Tricholoma mongolicum Imai）近年來逐漸走入人們的視野，其富含大量礦物元素尤以硒元素為首，僅次于靈芝被譽為“抗癌之王”[4]。因而，口蘑也經常被添加到食品中作為功能食品開發的不二之選，例如，莜面馬鈴薯口蘑餅干[5]、口蘑黃酮富硒飲料[6]、褐口蘑蜜餞[7]等。酸奶早已成為整個新生代和健康人群首選佳品[8]，如百香果酸奶[9]、大豆酸奶[10]等。將口蘑添加到酸奶中，研制出一款口蘑酸奶，不僅較水果酸奶蛋白含量豐富，且微量元素更勝大豆酸奶，為口蘑綜合開發利用開辟一條新的途徑，也為食用菌在食品行業中的應用提供思路和參考。本文結合響應面法優化口蘑酸奶工藝，響應面法可將響應值受多個因素影響的問題建模分析，便捷地與隨機仿真和確定性仿真問題結合起來，因而越來越多的被應用到各個領域，尤其是食品工業[11]。

1 實驗

1.1 材料與儀器

伊利高蛋白脫脂高鈣奶粉，市售鮮口蘑，惠宜白砂糖，尚川優養酸奶發酵菌（嗜熱鏈球菌、雙歧兩歧桿菌TMC3115，德氏乳桿菌保加利亞亞種）。

V-5600型可見分光光度計，SHZ-D(Ⅲ)型循環水式真空泵，ZCZY-CS8型搖床。

1.2 方法

1.2.1 口蘑酸奶制備(1工藝流程。

(2)口蘑汁的制備。取新鮮口蘑30 g，加90 mL蒸餾水榨汁，混勻過濾制得口蘑汁。

(3)復原乳制備。取16 g乳粉加入200 mL蒸餾水，將白砂糖按比例加入，溶解后放入-4℃冰箱備用。(4)均質、殺菌。將口蘑汁和復原乳按比例混合（不扣除口蘑自身含水量），放入均質機均質，充分溶解后加熱至90℃，并保持15 min。

(5)接種、去沫、灌裝、發酵。殺菌后的混合乳快速冷卻至40℃，然后在無菌操作臺上按比例加入發酵劑，混勻后去沫，攪拌均勻后分裝在酸奶杯中，封口，42℃恒溫培養箱內發酵24 h。

(6)冷卻后熟。發酵結束后在室溫下冷卻20 min，-4℃冷藏至少4 h以上。

1.2.2 感官評定

依據表達力、準時性、對試樣態度及健康狀況等篩選福州大學至誠學院10名學生作為評分員（18～24歲，7女3男）進行為期3個月的酸奶感官評定[12]訓練。每日選取同一時間段（15:00～16:00）評分，評分當天評分員需至少空腹3 h，并用純凈水漱口3次。被評酸奶樣品統一用無色透明玻璃杯（200 mL）盛放100 mL。參考國家標準GB 19302-2010《食品安全國家標準發酵乳》[13]適當修改，對口蘑酸奶的色澤10分、香氣20分、組織形態35分、滋味35分進行感官評定，見表1，去除一個最高分和一個最低分，取平均值作為最后感官評分數。

表1感官評定指標

1.2.3 單因素實驗

考察口蘑汁添加量（質量分數4%，6%，8%，10%，12%，14%，16%）；白砂糖添加量（20，40，60，80，100 g/L，下同）；發酵劑添加量（10，20，30，40，50 g/L）。兩組平行實驗。

1.2.4 響應面分析

根據單因素實驗結果，以口蘑汁添加量、白砂糖添加量、發酵劑添加量三因素進行響應面實驗設計[11]，以感官評定分值為響應指標。通過Desigin expert 8.0軟件對實驗數據進行回歸分析，預測口蘑酸奶最佳工藝參數，見表2。

表2響應面實驗因素水平

結果分析采用響應面軟件Box-Behnken模型設計分析，Sigmaplot Graph作圖。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 口蘑汁添加量對感官評定的影響

對口蘑酸奶感官評定分值進行統計分析，口蘑汁添加量對感官評定分值的影響差異較大。感官評定的分值隨口蘑汁添加量的增加先增大后降低，口蘑汁添加量在12%時，感官評定值達到最大78.8分，之后隨口蘑汁添加量增大而下降如圖1所示。由于口蘑有些許腥味[14]，添加量超過12%會使口蘑酸奶腥味加重，添加量過低會影響口蘑酸奶營養價值。因此，口蘑汁添加量在10%～14%之間最為合適。

圖1口蘑汁添加量對口蘑酸奶感官評定分值的影響

2.1.2 白砂糖添加量對感官評定的影響

固定口蘑汁添加量12%，感官評定的分值隨口蘑汁添加量的增加呈現先增大后降低的趨勢。在白砂糖添加量60 g/L時，感官評定分值達到最高為81.9分。當白砂糖添加量達到100 g/L時，口蘑酸奶感官評定分值略有增加，可能是甜度過高影響味蕾[15]，導致滋味分值略有增高，同時，白砂糖添加量過多，口蘑酸奶香氣更濃，此項評分也略高。白砂糖添加量低于20 g/L時，口蘑酸奶的甜度不足，影響酸奶滋味，而超過100 g/L，口蘑酸奶甜度過高，口感會甜膩[15]。因此，白砂糖添加量選在40～80 g/L之間。

2.1.3 發酵劑添加量對感官評定的影響

將嗜熱鏈球菌、雙歧兩歧桿菌TMC3115及德氏乳桿菌保加利亞亞種按質量比1∶2∶1混合[16]，可以起到互補作用，在發酵過程中可以相互促進[17-18]。在固定口蘑汁添加量12%，白砂糖添加量60 g/L條件下，口蘑酸奶感官評定分值隨發酵劑添加量的增加而緩慢升高，添加量為30 g/L時，感官評定分值最高達85.0分，此后感官評定分值緩慢下降。因此，發酵劑添加量以30 g/L為宜。發酵劑添加量低于10 g/L酸奶發酵不充分，而超過50 g/L會導致發酵過度，不利于酸奶保存[19]。則發酵劑添加量應選在20～40 g/L之間。

圖2白砂糖添加量對口蘑酸奶感官評定分值的影響

圖3發酵劑添加量對口蘑酸奶感官評定分值的影響

2.2 響應面法優化口蘑酸奶發酵工藝

2.2.1 響應面實驗設計及二次多項式回歸模型建立

實驗共設計17個試驗點（見表3），并對實驗數據進行分析得出回歸方程為

2.2.2 方差分析和二次元回歸方程擬合

本實驗模型的Prob＞F(a)值，表明該模型極其顯著，（見表3）；軟件分析得到模型的相關系數R2=0.9910，=0.9794，大于0.9且接近于1，說明模型相關度很好[20]；變異系數(CV)為0.74，該值較低小于1（見表4），反映了此模型的置信度較高，說明此模型方程能很好地反映真實的實驗值，因此可以使用此模型來分析響應值的變化[21]。預測值與實際值不擬合的概率通常用模型失擬項表示[22]，此模型失擬項P=0.2295（＞0.05），說明失擬項不顯著，模型選擇合適，試驗誤差小，可用此模型對口蘑酸奶的工藝進行分析和預測，見表3。

回歸方程(1)中x2，x1x3，x12，x22，x32對口蘑酸奶感官品質的影響極顯著（P＜0.01），x1、x3、x1x2對口蘑酸奶感官品質的影響顯著（P＜0.05），而x2x3對口蘑酸奶感官品質的影響不顯著（P＞0.05）說明發酵劑和白糖添加量交互作用較小，見表3，這可能與發酵菌株對底物糖類物質的依賴性較低有關[18]。優化回歸模型得回歸方程為

表3口蘑酸奶Box-Behnken模型實驗設計結果

可見，口蘑汁、發酵劑和白砂糖添加量對口蘑酸奶色澤、香氣、組織形態、滋味影響影響較大。

表4二次回歸模型的方差分析結果

2.2.3 交互作用分析

為進一步明晰各因素間的交互作用及確定最佳點，繪制響應曲面圖及其投影而成的等高線圖，通過觀察三維曲面圖的傾斜程度、等高線的形狀和密集程度來剖析各因素對感官評分結果的影響以及兩兩因素間的交互作用。曲面坡度越陡峭，影響越顯著；坡度越平坦，影響越不顯著。橢圓和等高線疏離表明交互作用越顯著；圓形和等高線密集表明交互作用越不顯著[23]。

圖4口蘑汁和白砂糖添加量對口蘑酸奶感官評定分值的影響

圖5口蘑汁和發酵劑添加量對口蘑酸奶感官評定分值的影響

固定發酵劑添加量30 g/L，口蘑汁和白砂糖添加量兩因素的響應面三維圖傾斜程度較大（圖4(a)），等高線近似呈現橢圓形（圖4(b)），說明兩個因素的影響顯著，兩因素交互作用顯著（P＜0.05）[24]。口蘑酸奶的感官評定分數隨口蘑汁和白砂糖添加量增加呈現先升高后下降的趨勢，口蘑汁添加量軸向等高線更為稀疏，白砂糖添加量軸向等高線相對密集，說明兩因素變化時，口蘑汁對感官評定分值的影響相對較大（圖4(b)）。此外，響應曲面圖開口向下，表明在實驗所選范圍內存在極大值，在口蘑汁添加量12%～13%、白砂糖添加量50～70 g/L內為最佳水平范圍。

圖6發酵劑和白砂糖添加量對口蘑酸奶感官評定分值的影響

固定白砂糖添加量30 g/L，口蘑汁和發酵劑添加量兩因素的響應面三維圖傾斜程度較陡峭（圖5(a)），等高線呈橢圓形（圖5(b)），說明兩個因素的影響極顯著，兩因素交互作用極顯著（P＜0.01）[24]。口蘑酸奶的感官評定分值隨口蘑汁和發酵劑添加量的增加先升高后下降，口蘑汁添加量軸向等高線更為稀疏，發酵劑添加量軸向等高線相對密集，說明兩因素變化時，口蘑汁對感官評定分值的影響相對較大（圖5(b)）。此外，響應曲面圖開口向下，表明在實驗所選范圍內存在極大值，在口蘑汁添加量12%～13%、發酵劑添加量30～40 g/L內為最佳水平范圍。

固定口蘑汁添加量12%，發酵劑和白砂糖添加量兩因素的響應面三維圖傾斜程度較小（圖6(a)），等高線近似呈圓形（圖6(b)），說明兩個因素的影響不顯著，兩因素交互作用不顯著（P＞0.05）[24]。口蘑酸奶的感官評定分值隨口蘑汁和白砂糖添加量的增加呈先升后降的趨勢，白砂糖和發酵劑的添加量軸向等高線都較為密集，說明兩因素對感官評定分值的影響都相對較小（圖6(b)）。此外，響應曲面圖開口向下，表明在實驗所選范圍內存在極大值，在發酵劑添加量30～40 g/L、白砂糖添加量50～70 g/L內為最佳水平范圍。

綜上所述，兩因素交互作用的影響顯著性由大到小為：口蘑汁和發酵劑添加量交互作用＞口蘑汁和白砂糖添加量交互作用＞發酵劑和白砂糖添加量交互作用。

2.3 最佳工藝確定與驗證

口蘑汁、白砂糖和發酵劑添加量對口蘑酸奶的感官評定分值顯著影響，經模型預測可得最佳工藝條件為：口蘑汁添加量12.26%，白砂糖添加量64 g/L，發酵劑添加量33.2 g/L，口蘑酸奶的感官評定分值模型預測值為88.76分。便于實驗操作，修訂工藝條件為：蘑汁添加量12.3%，白砂糖添加量64 g/L，發酵劑添加量33 g/L，在此條件下進行三次驗證實驗，測得實際口蘑酸奶的感官評定分值為(88.93±0.37)分，與預測值偏離在0.19%左右。

3 結論

以感官評定分值為指標，利用響應面的Box-Behnken模型研究了口蘑汁、白砂糖和發酵劑添加量對口蘑酸奶感官評定分數的影響,建立二次多項式模型（P＜0.001），在分析預測最優組合的基礎上，通過實驗驗證最終獲得優佳工藝：蘑汁添加量12.3%，白砂糖添加量64 g/L，發酵劑添加量33 g/L，口蘑乳酸菌酸奶的感官評定分數(88.93±0.37)分。所得產品奶香濃郁并散發口蘑獨特的香味，口感絲滑鮮美，則應用響應面法研究食用菌乳酸菌酸奶工藝是切實可行的，且為食用菌的開發和利用提供新的思路和參考。