獼猴桃籽油微乳液氧化穩定性及體外抗氧化活性研究

蔡程晨，朱式業，熊武國，李加興，，易 倩，張廣艷

（1.吉首大學化學化工學院，湖南吉首 416000；2.吉首大學林產化工工程湖南省重點實驗室，湖南張家界 427000；3.湖南省澧縣中醫醫院，湖南澧縣 415500）

獼猴桃又叫藤梨、陽桃、獼猴梨[1]，其主要營養成分含量位居其他水果前列，因而有“水果之王”的美譽[2]。現有研究結果表明，獼猴桃果實中含種籽0.8%～1.6%，千粒質量1.2～1.6 g，含油量高達35.6%。獼猴桃籽油中亞油酸、亞麻酸等多不飽和脂肪酸占75%以上，特別是亞麻酸含量達64.1%，這是目前發現的除蘇子油外亞麻酸含量最高的天然植物油[3]。有研究表明，獼猴桃籽油具有調節血脂、延緩衰老等保健功能和護膚功效[4]。由此可見，把獼猴桃籽油用于護膚品領域具有十分廣闊的前景。

存在過多對機體有破壞作用的自由基，如超氧陰離子、羥基自由基等活性氧自由基會在生物機體正常代謝過程中會產生。在正常情況下，機體產生的過多自由基會循序被體內的清除劑所清除，因而機體自由基處于一種動態平衡之中。如果失衡或者清除過慢，過多的自由基會使生物大分子受到攻擊，加速機體的衰老進程，并誘發炎癥、惡性腫瘤、免疫失調等多種疾病[5]。一方面可通過運動來保證身體內的自由基正常，另一方面人們將研究重點放在了抗氧化劑的應用上。目前，大部分的抗氧化劑都是通過化學合成的，會影響到人體健康，因而天然抗氧化劑引起了人們的廣泛關注。

獼猴桃籽油作為一種天然抗氧化劑因富含多烯酸、易于氧化而制約了其應用，成為在食品與日化品應用領域中的技術瓶頸，因而將其制備成微乳液以提高其氧化穩定性，可進一步擴大其應用范圍。因此，試驗以W/O型獼猴桃籽油微乳液為研究對象，采用加速氧化試驗與體外抗氧化模型探討獼猴桃籽油微乳液的氧化穩定性和體外抗氧化活性，可為獼猴桃籽油微乳液在食品與日化品領域的開發應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

獼猴桃籽油，湖南優鎰農業開發有限公司提供，采用超臨界萃取工藝提取；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、無水乙醇、三羥甲基氨基甲烷、濃鹽酸、氫氧化鈉、焦性沒食子酸、過氧化氫、七水合硫酸亞鐵、水楊酸等，均為分析純。

1.2 儀器與設備

FA2014型電子天平、7230G型可見光分光光度計，上海舜宇恒平科學儀器有限公司產品；電子萬用爐，天津市泰斯特儀器有限公司產品；HH-S型水浴鍋、DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鄭州長城科工貿有限公司產品；800型電動離心機，常州市金環區環宇科學儀器廠產品；UV-2450型紫外分光光度計，日本島津公司產品；BCD-215TS型冰箱，青島海爾股份有限公司產品；GZX-9146·MBE型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海博訊實業有限公司醫療設備廠產品；PHS-3C型pH計，上海儀電科學儀器股份有限公司產品。

1.3 試驗方法

1.3.1 獼猴桃籽油微乳液的制備方法

首先，將復合表面活性劑（吐溫和司盤） 和助表面活性劑按2∶1混合，再按1∶1比例加入IPM與獼猴桃籽油混合油相，然后用微量滴定管逐滴加入去離子水，同時在一定溫度下攪拌，直至溶液由渾濁變為澄清（形成微乳液），即可得到獼猴桃籽油微乳液。

1.3.2 獼猴桃籽油微乳液氧化穩定性試驗

采用加速氧化試驗探討獼猴桃籽油微乳液和普通獼猴桃籽油的氧化穩定性。將獼猴桃籽油微乳液和普通獼猴桃籽油放置在65℃干燥箱中，每隔24 h測定其過氧化值，探討不同貯藏時間對獼猴桃籽油微乳液氧化穩定性的影響。

1.3.3 還原能力測定試驗

將獼猴桃籽油微乳液用無水乙醇分別配制成質量濃度為2，4，6，8，10 mg/mL的獼猴桃籽油微乳液，分別取1 mL上述獼猴桃籽油微乳液于試管中，依次加入0.2 mol/mL pH值6.6的磷酸鹽緩沖液2.5 mL，1%鐵氰化鉀2.5 mL，混勻，于50℃水浴中保溫20 min，再加入10%三氯乙酸2.5 mL，混勻，以轉速3 000 r/min離心10 min后取上清液2.5 mL于試管中，加去離子水2.5 mL和0.1%三氯化鐵0.5 mL，常溫反應5 min后于波長700 nm處測定吸光度[6]，以吸光度大小評價還原能力的高低。以相同濃度VE為陽性對照，臨用前以無水乙醇配制成與試驗獼猴桃籽油微乳液同等濃度的對照液。做3次平行。

1.3.4 體外抗氧化活性試驗

（1） O2-·清除試驗。將獼猴桃籽油微乳液用無水乙醇分別配制成質量濃度為3，6，9，12，15 mg/mL，各加入0.05 mol/L的Tris-HCl緩沖液4.5 mL于試管中，置于25℃水浴鍋預熱20 min后，分別取1 mL上述獼猴桃籽油微乳液和3 mmol/L的鄰苯三酚溶液0.1 mL，混勻，于25℃下反應5 min后加入濃度8 mmol/L的HCl溶液1 mL終止反應，于波長299 nm處測定樣品溶液的吸光度A1[7]。以相同濃度VE為陽性對照，蒸餾水做空白對照，做3次平行。按下式計算對·的清除率：

式中：A1——1 mL樣品液+4.5 mL Tris-HCl緩沖液+0.1 mL鄰苯三酚溶液+1 mL HCl溶液；

A2——1 mL樣品液+4.5 mL Tris-HCl緩沖液+0.1 mL鄰苯三酚溶液+1 mL無水乙醇溶液；

A3——1 mL蒸餾水+4.5 mL Tris-HCl緩沖液+0.1 mL鄰苯三酚溶液+1 mL HCl溶液。

（2） DPPH·清除試驗。將獼猴桃籽油微乳液用無水乙醇分別配制成質量濃度為40，80，120，160，200 mg/mL，分別取3 mL上述超微細獼猴桃籽油溶液于試管中，加入濃度0.2 mmol/L的DPPH·溶液2 mL，混勻后避光靜置30 min，于波長517 nm處測定吸光度[8]。以相同濃度VE為陽性對照，臨用前以無水乙醇配制成與試驗獼猴桃籽油微乳液同等濃度的對照液。蒸餾水做空白對照，做3次平行。按下式計算對DPPH·的清除率：

式中：A1——3 mL樣品溶液+2 mL DPPH·溶液；

A2——3 mL樣品溶液+2 mL無水乙醇溶液；

A3——3 mL蒸餾水+2 mL DPPH·溶液。

（3） ABTS+·清除試驗。將 7.4 mmol/L ABTS+·的K2S2O8溶液（K2S2O8濃度為2.6 mmol/L） 在室溫避光保存12 h，制得ABTS+·儲備液。經磷酸鹽緩沖液（pH值7.4） 稀釋，使其在波長734 nm處的吸光度達到0.70±0.02，得到ABTS+·自由基工作液。將獼猴桃籽油微乳液用無水乙醇分別配制成質量濃度為20，40，60，80，100 mg/mL，分別取0.2 mL樣品溶液與試管中，加入0.8 mL ABTS+·工作液混合，振搖10 s，以充分混合，暗處反應6 min，于波長734 nm處測定吸光度[9]，以相同濃度VE為陽性對照，做3次平行。結果用ABTS+·清除率表示。

式中：A1——0.8 mL ABTS+·工作液+0.2 mL樣品溶液；

A2——0.8 mL ABTS+·工作液+0.2 mL無水乙醇。

（4）·OH清除試驗。將獼猴桃籽油微乳液用無水乙醇分別配制成質量濃度為12，16，20，24，28 mg/mL，分別取1 mL上述獼猴桃籽油微乳液于試管中，依次加入濃度為6 mmol/L FeSO4溶液1 mL，濃度為6 mmol/L水楊酸乙醇溶液1 mL，最后加入濃度為8mmol/L的H2O2溶液1 mL以啟動反應，于37℃水浴中加熱30 min后終止反應，于波長510 nm測定吸光度A1[10]。以相同濃度VE為陽性對照，臨用前以無水乙醇配制成與試驗獼猴桃籽油微乳液同等濃度的對照液。蒸餾水做空白對照，做3次平行。按下式計算·OH清除率：

式中：A1——1 mL樣品溶液+1 mL FeSO4溶液+

1 mL水楊酸乙醇溶液+1 mL H2O2溶液；

A2——1 mL樣品溶液+1 mL FeSO4溶液+1 mL水楊酸乙醇溶液+1 mL無水乙醇溶液；

A3——1 mL蒸餾水+1 mL FeSO4溶液+1 mL水楊酸乙醇溶液+1 mL H2O2溶液。

1.3.5 過氧化值測定方法

按照GB 5009.227—2016食品安全國家標準 食品中過氧化值的測定方法進行測定。1.3.6 數據分析

所有試驗數據均采用平均差±標準差，利用Origin 8.5軟件對數據進行處理并繪制圖表。

2 結果與分析

2.1 獼猴桃籽油微乳液的氧化穩定性

貯藏時間對獼猴桃籽油微乳過氧化值的影響見圖1。

圖1 貯藏時間對獼猴桃籽油微乳過氧化值的影響

由圖1可知，在烘箱加速氧化試驗中，普通獼猴桃籽油和獼猴桃籽油微乳液的過氧化值均隨貯藏時間延長而升高，獼猴桃籽油原油增幅為8.71，而獼猴桃籽油微乳液過氧化值的增幅僅為0.15，表明獼猴桃籽油微乳液的抗氧化穩定性優于普通獼猴桃籽油，與加入的表面活性劑本身具有抗氧化活性有關[11]。

2.2 獼猴桃籽油微乳液的還原力測定

獼猴籽油微乳還原能力的曲線見圖2。

圖2 獼猴籽油微乳還原能力的曲線

由圖2可知，獼猴桃籽油微乳液和VE還原力均呈線性增長趨勢。根據還原能力的測定方法，在波長700 nm處測定的吸光度越大，則抗氧化劑的還原能力越強[12]。還原力強的溶液同時也是良好的電子供應者，其供應的電子除了Fe3+還原為Fe2+外，也參與自由基反應，與自由基結合生成穩定的物質。說明在還原力能力上，VE的抗氧化能力高于獼猴桃籽油微乳液。

2.3 獼猴桃籽油微乳液體外抗氧化活性

2.3.1 獼猴桃籽油微乳液對O2-·清除率的影響

O2-·通常作為自由基鏈式反應的引發劑，可以經過一系列反應產生其他自由基，進一步對機體造成危害[13]。因此，研究獼猴桃籽油微乳液對O2-·的清除能力是研究其抗氧化活性的重要指標。

獼猴桃籽油微乳質量濃度對O2-·清除率的影響見圖3。

由圖3可知，獼猴桃籽油微乳液對O2-·的清除能力隨著質量其濃度的增加而提高。這是因為獼猴桃籽油微乳液中富含多酚類物質[14]，可提供氫原子（或正電子），使自由基轉變為非活性的或較為穩定的化合物，從而能中斷自由基的鏈鎖反應[15]。當質量濃度超過12 mg/mL時，獼猴桃籽油微乳液對O2-·的清除作用趨于平緩，當其質量濃度達到15 mg/mL時，清除率達87.57%，呈現出良好的O2-·清除能力。

2.3.2 獼猴桃籽油微乳液對清除DPPH·的影響

圖3 獼猴桃籽油微乳質量濃度對O2-·清除率的影響

當有自由基清除劑存在時，DPPH·的單電子被捕捉而使其顏色變淺，其褪色程度與其接受的電子數量成定量關系，因而可用分光光度計進行快速的定量分析，從而評價試驗樣品的抗氧化能力。此抗氧化能力用清除率表示，清除率越大，抗氧化能力越強[16]。

獼猴桃籽油微乳液質量濃度對DPPH·清除率的影響見圖4。

圖4 獼猴桃籽油微乳液質量濃度對DPPH·清除率的影響

由圖4可知，獼猴桃籽油微乳液和VE均對DDPH·有清除能力，且隨著質量濃度的增加而增加。當質量濃度超過160 mg/mL后，獼猴桃籽油微乳液對DPPH·清除能力比VE的清除能力要高，而DPPH·的清除活性與抗氧化劑分子中有效酚羥基的數目與新形成的抗氧化劑自由基的穩定性有關[17]。由此推斷獼猴桃籽油微乳液具有良好的DPPH·清除能力。

2.3.3 獼猴桃籽油微乳液對ABTS+·清除率的影響

ABTS+·的清除原理是電子轉移過程，并且較DPPH·更容易發生反應。ABTS+·水溶液與過硫酸鉀避光反應后，形成深藍色的ABTS+·儲備液，當加入不同質量濃度微乳液和VE時，儲備液顏色變淺，測得吸光度的減少幅度，即為微乳液和VE對自由基的清除率。

獼猴桃籽油微乳液質量濃度對ABTS+·清除率的影響見圖5。

圖5 獼猴桃籽油微乳液質量濃度對ABTS+·清除率的影響

由圖5可知，在20～100 mg/mL范圍內ABTS+·清除率與獼猴桃籽油微乳和VE溶液之間呈良好的線性關系。因為酚類化合物的抗氧化活性不僅取決于取代基的供電子效應，還取決于酚羥基周圍空間位阻[18]。由于VE的側鏈能夠直接參與到細胞的氧化還原過程，使得自由基的活力降低。因此，VE清除ABTS+·的能力比較獼猴桃籽油微乳液好。

2.3.4 獼猴桃籽油微乳液對·OH清除率的影響

和其他自由基相比，·OH是體內最活躍的活性氧自由基，產生于生命活動的氧化代謝過程，可使氨基酸、蛋白質、脂類和核酸等大分子發生氧化損傷，誘導細胞凋亡或使轉化細胞脫離正常細胞的控制無限生長而癌變[19]。

獼猴桃籽油及其微乳質量濃度對·OH清除率的影響見圖6。

圖6 獼猴桃籽油及其微乳質量濃度對·OH清除率的影響

由圖6可知，獼猴桃籽油微乳液和VE對·OH的清除能力有所差異，但均表現出了清除能力，并且呈明顯劑量依賴關系。獼猴桃籽油微乳液對·OH清除率在不同質量濃度時明顯高于VE的清除率，兩值相差40%以上。

3 結論

（1）獼猴桃籽油微乳液的過氧化值隨貯藏時間的延長而逐漸升高，但遠低于普通獼猴桃籽油，說明獼猴桃籽油微乳液具有較好的抗氧化穩定性。

（2）獼猴桃籽油微乳液的體外抗氧化試驗結果表明，獼猴桃籽油微乳液具有一定的還原力和自由基清除能力，其抗氧化能力與其質量濃度有較好的量效關系。當質量濃度為15 mg/mL時，獼猴桃籽油微乳液對O2-·清除率為87.57%。

（3）獼猴桃籽油微乳液可清除自由基、阻斷自由基鏈式反應，在一定質量濃度范圍內能抑制自由基的氧化損傷，這為獼猴桃籽油微乳液的進一步研究和應用提供了理論依據，也可為獼猴桃資源的綜合開發利用提供一條新途徑。