應用二重PCR技術檢測肉制品中的肉源性成分

李慧潔，蔣會敏，賈小同，李小艷，王利娜，尹皓月，李 鈾

（西北民族大學生命科學與工程學院，甘肅蘭州 730124）

隨著經濟的發展，人們的消費水平也逐步提高，消費者對食品的安全性有了更高的要求，在國內及國際貿易中，牛、羊肉中摻雜價格便宜的鼠、貓、兔、豬等肉類，以次充好的欺騙行為屢見不鮮，嚴重損害了消費者的利益。在穆斯林國家和地區，肉類食品的摻假不僅僅是經濟問題，更是宗教問題。在市場中，牛、羊肉中摻雜價格便宜的鼠、貓、兔、豬等肉類，以次充好獲取高額利益，加之近年來瘋牛病、羊瘙癢癥等疾病的出現，肉源性成分的鑒定刻不容緩。隨著PCR技術在摻假肉檢測中的引入，PCR法、多重PCR法和實時熒光PCR以其高靈敏度和強特異性逐漸成為肉類鑒別的主要分析方法[1-2]。其中，多重PCR法具有反應體系中可擴增出多段目的DNA片段[3]的優勢，Tettelin H等人[4]已成功進行了15多對引物的多重PCR。PCR技術是一種用于體外擴增DNA片段的方法，其反應原理類似于 DNA的半保留復制過程，它的特異性表現在與靶序列兩端互補的核苷酸引物上。人為地給試管中的待擴增目標DNA樣品提供合適的環境條件，如模板 DNA、核苷酸引物、DNA聚合酶和合適的緩沖液體系等反應所需物質，通過控制反應液溫度和反應時間實現DNA變性、退火及延伸3個基本過程，然后重復3個反應過程，在若干循環后實現DNA片段呈指數倍擴增。多重PCR技術[5]就是指在單一PCR技術的基礎上進行改進的一種技術，是將多條引物和多條模板混合在一個反應體系中分別特異擴增不同的目的條帶，或者多條引物和單一的模板DNA混合在同一反應體系中擴增同一模板的不同片斷，常用于對超長片斷的擴增。和傳統單一的PCR技術相比，多重PCR技術具有高效性、系統性和經濟簡便的特點。

PCR技術具有上述突出優點，人們將這一技術應用到不同的領域，使之迅速發展，取得了巨大的成果，如從事食品病原菌檢測的研究人員將這種技術引入到食品檢測領域。近年來，基于反應的基本原理，許多學者對PCR技術進行研究和改進，使之得到進一步完善，并在此基礎上派生出了許多新的用途[6]。

1 材料與方法

1.1 材料

在市場上購買生鮮的牛肉、豬肉、雞肉和羊肉，保存于-4℃冰箱中。

1.2 試劑與器材

細胞裂解液、7.8 mol/L醋酸銨，異丙醇，1X TEL，Buffer TE，70%乙醇，dNTPS（2.5 mmol/L），瓊脂糖，蛋白酶K（100μg/mL），細胞裂解緩沖液，SDS 10%，胰RNA酶 20μg/mL，TE緩沖液（pH值8.0），酚，氯仿，異戊醇（25∶24∶1），冷無水乙醇，高壓滅菌鍋，以及PCR相關試劑（Premix Taq Version2.0，Takara，500μL）、PCR 儀 （MyGeneTML Series Peltire Thermal Cycler） 和電泳儀（瓊脂糖水平電泳）。

1.3 試驗步驟[7-21]

1.3.1 二重PCR反應體系建立

（1） DNA提取。運用Gentra Puregene Extraction Kit（Gentra Systems Inc.）提供的方法提取肉制品混合物DNA，提取的DNA保存在TE溶液里，作為PCR反應的模板。用紫外分分光度計測試DNA濃度。

（2） 引物設計。從文獻里分別查到豬（Cytb）、牛 （Cytb）、雞 （12S rRNA）、羊 （Cytb） 的引物序列，由Takara公司合成（Takara，中國），保存于-20℃冰箱中。

（3） 單重 PCR擴增。

單重PCR中不同動物擴增的目的基因名稱與大小、擴增的引物序列、長度和退火遞度詳見表1，單重PCR反應體系詳見表2，單重PCR反應程序詳見表3。

1.3.2 二重PCR反應體系的優化

表1 引物的DNA序列、預擴增片段長度、引物名稱、退火梯度

表2 單重PCR反應體系

表3 單重PCR反應程序

按照擴增的目標基因大小，將4種動物兩兩組合，即豬牛、牛雞、牛羊、豬雞，豬羊。由于雞和羊大小近似，不容易區別，因此二重PCR不考慮雞羊組合。

為獲得最佳的二重PCR反應體系，首先嘗試了不同的引物濃度、DNA濃度和Premix Taq的濃度，具體PCR反應體系如下：

（1） 2種動物的上、下游引物各為1μL，Premix Taq 12.0μL，2種模板DNA各加3.5μL，ddH2O 2μL，體系總體積為25.0μL。

（2） 2種動物的上、下游引物各為1μL，Premix Taq 12.0μL，2種模板DNA各加6.0μL，ddH2O 2μL，體系總體積為30.0μL。

（3） 2種動物的上、下游引物各為1μL，Premix Taq 12.0μL，2種模板DNA各加3.0μL，ddH2O 3μL，體系總體積為25.0μL。

（4） 2種動物的上、下游引物各為0.5μL，Premix Taq12.5μL，2種模板DNA各加3.0μL，ddH2O4.5μL，體系總體積為25.0μL。

（5） 2種動物的上、下游引物各為0.5μL，Premix Taq 12.0μL，2種模板DNA各加3.0μL，ddH2O 5μL，體系總體積為25.0μL。

同時為獲得二重PCR中不同引物組合的最佳退火溫度，試驗中為每組引物設置55～64℃的溫度梯度，因此每組動物需要10個重復，為避免加樣時試劑的損失，配置Mastermix時按照12個樣本量的試劑量加樣。

最佳退火溫度的確立——二重PCR反應體系見表2。

表2 最佳退火溫度的確立——二重PCR反應體系

2 結果與分析

2.1 二重PCR反應體系建立結果

經電泳結果檢測得出，豬、牛、雞和羊的PCR擴增片段大小分別為204，472，131，119 bp。由于雞和羊的擴增片段大小過于接近（131和119bp），電泳圖上不易區分，因此試驗中的二重PCR體系使用了5種動物組合，分別為牛和豬、牛和雞、牛和羊、豬和雞、豬和羊。最終確立的二重PCR為25μL體系，包含12.5μL的Premix Taq，每條引物0.4μmol/L，以及每種動物DNA 3～4μL。二重PCR反應條件為預變性94℃ 3 min，35個循環：94℃ 30 s，55℃30 s，72℃ 30 s；延伸72℃ 5 min。

2.2 二重PCR體系優化結果

豬羊、豬雞二重PCR結果見圖1。

圖1 豬羊、豬雞二重PCR結果

圖1 左側中從上到下，分別是500 bp Marker、豬羊模板DNA 1～8、1 000 bp Marker。從圖中清楚可見豬羊模板DNA 1～3均出現了2條不同的明亮條帶，說明這3個豬羊DNA擴增較為成功。豬羊模板DNA 4～8均沒有出現條帶。圖中擴增的8個豬羊DNA模板，有3個擴增成功，說明在上述反應體系下擴增，豬羊的二重PCR擴增成功的概率較高，該反應體系可以用于擴增豬羊DNA。

圖1右下側中從上到下，分別是1 000 bp Marker、豬雞模板DNA 1～6。其中，豬雞模板DNA1～2出現2條明顯不同的條帶，圖中6個豬雞模板，有2個擴增成功，說明該反應體系可以用于研究擴增豬雞DNA。

雞羊DNA二重PCR結果見圖2。

圖2 雞羊DNA二重PCR結果

圖2 中所有的1 000 bp Marker與500 bp Marker跑的效果均較好，說明膠片制作效果較好。圖2左側為雞DNA的擴增結果，DNA條帶明亮位于1 000 bp Marker的 100～200 bp，位于 500 bp Marker的 100～150 bp，可以判斷出雞擴增長度為120 bp左右。圖2右側為羊DNA的擴增結果，DNA條帶明亮位于1 000 bp Marker的 100～200 bp，位于 500 bp Marker的 100～150 bp，可以判斷出雞擴增長度為130 bp左右。

豬牛DNA，雞牛DNA，牛羊DNA二重擴增結果見圖3。

圖3 豬牛DNA，雞牛DNA，牛羊DNA二重擴增結果

圖3 中所有的1 000 bp Marker與500 bp Marker跑得效果均較好，說明膠片制作效果較好。圖3左側為豬牛DNA擴增的DNA條帶，從上到下分別為豬牛DNA 1～9，其中豬牛DNA 1～5均只有1條DNA條帶，說明這5個的豬牛DNA擴增失敗；豬牛DNA 6～9均有2條明亮的DNA條帶，說明這4個DNA在該反應體系下擴增較為成功。圖3右上為牛羊DNA擴增的條帶，從上到下分別為牛羊DNA 1～4，這4個DNA均擴增出了2條明亮的DNA條帶，說明在上述反應體系下擴增較為成功。圖3右下為雞牛DNA擴增條帶，從上到下分別為雞牛DNA 1～5，這5個DNA均擴增出了2條明亮的DNA條帶，說明在此反應體系下擴增較為成功。

5種動物的二重PCR結果見圖4。

圖4 5種動物的二重PCR結果

3 結論

運用單重PCR技術擴增牛、豬、雞、羊的DNA，并對每個樣品做梯度PCR，以尋找各對引物最接近的適宜的退火溫度，為后期二重PCR試驗做準備。豬、牛、雞、羊的退火溫度范圍接近，由于雞羊目的條帶大小十分相同，在電泳圖上不易于區分，因此在二重PCR時不考慮作為模板DNA。

在二重PCR中通過對PCR反應體系的優化，尤其是針對6種不同的動物模版組合（牛豬、牛雞、牛羊、豬雞、豬羊、雞羊），設置退火溫度梯度55～64℃范圍后，對6種二重PCR的電泳圖進行了比較，最終確立了55℃為最佳退火溫度。并且6種動物模版組合中，由于雞羊組合的目標條帶大小近似（119 bp和131 bp），電泳圖上不宜區分，因此最終選擇了5種二重PCR：牛豬、牛雞、牛羊、豬雞、豬羊，其反應體系均為25μL總體積，上下引物各1μL，模版DNA 3～4 μL，Premix Taq 12.5 μL。反應條件為預變性94℃3 min，35個循環：94℃30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s；延伸72℃ 5 min。

引物特異性和融合溫度在多重PCR試驗中是非常關鍵的，因其成功取決于在單重PCR條件下引物與其各自靶標選擇性退火的能力，包括反應體系、循環次數和退火溫度。故引物設計是PCR發展中十分重要的一步，需包含足夠的種內保守序列和密切相關的Tm的種間多態性。

快速檢測出更多肉品的種類和摻假，仍然是我國學者研究的重點對象，運用多重PCR方法似乎是最為快速的一種方式，它具有極高的準確性，為此希望通過該方法建立一種快速、高效和同時檢測肉制品中多種肉源性成分的方法，為肉類摻假提供更為有利的證據。