蛇床子素通過上調抑癌基因PTEN抑制肝癌細胞HepG2增殖并促進細胞凋亡①

賈廷印 李好朝 喬澤強 王立義

(南陽醫學高等專科學校第一附屬醫院普通外科，南陽 473058)

肝細胞癌是最常見的肝臟原發性惡性腫瘤，也是導致癌癥患者死亡的第三大主要原因[1-3]。目前對于肝細胞癌的治療主要以傳統的放療和化療為主，但由于肝癌細胞對大多數的放化療藥物不敏感，導致傳統療法收效甚微[4，5]。蛇床子素是從中藥蛇床子提取的一類香豆素衍生物，中醫常用其治療濕疹、皮膚瘙癢和滴蟲感染等疾病[6]。現代研究表明蛇床子素具有抗炎、抗過敏、抗菌和抗骨質疏松等藥理學活性[7-10]。此外，蛇床子素還能夠抑制多種癌細胞活性，誘導癌細胞凋亡[11-13]。研究表明，蛇床子素可通過抑制NF-κB信號通路誘導細胞周期阻滯，從而抑制肝癌細胞生長、促進癌細胞凋亡[14]，并且其還能通過誘導細胞周期阻滯抑制骨肉瘤細胞的侵襲和遷移能力，其作用機制與調控PTEN/Akt信號通路有關[15]。PTEN是一類抑癌基因，其在多種癌癥中都呈低表達狀態，上調PTEN表達可減緩肝癌的發展[16-19]。本實驗對蛇床子素的抗肝癌作用與PTEN的關系進行研究，從而為蛇床子素應用于臨床治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器 CCK8試劑盒和BCA試劑盒購自碧云天生物技術公司。Ki67、增殖細胞核抗原(Proliferation cell nuclear antigen，PCNA)、Bax、Bcl-2、磷酸酶-張力蛋白基因(Phosphatase and tensin homolog gene，PTEN )一抗均購自美國Millipore公司。HRP標記二抗購自美國Sigma公司。流式細胞儀購自德國Partec公司。電泳儀和半干轉膜儀購自Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養 人正常肝細胞L02和人肝癌細胞HepG2由中國科學院昆明細胞庫提供。用含有10%胎牛血清的DMEM培養液進行培養，隔天換液，每3 d傳代一次。

1.2.2CCK8檢測細胞活性 將細胞接種于96孔板，并將細胞隨機分為0 μmol/L組、50 μmol/L組、100 μmol/L組和150 μmol/L組，每組6個復孔。每組分別加入相應濃度的蛇床子素分別處理0、1、2、3、4和5 d，隨后每孔加入10 μl CCK8試劑，繼續孵育2 h后于450 nm處檢測細胞吸光度。

1.2.3流式檢測細胞凋亡 用蛇床子素同時加入或不加入PTEN抑制劑bpV(HOpic)(1 μmol/L)處理細胞48 h后，用PBS洗滌細胞3次，0.25%胰酶收集細胞，用緩沖液重懸沉淀后，加入Annexin V和PI溶液室溫避光孵育10 min，用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況。

1.2.4Western blot檢測蛋白表達 用PBS清洗細胞，RIPA裂解液提取各組細胞總蛋白，并用BCA試劑盒檢測蛋白濃度并調平。用10% SDS-PAGE分離蛋白質并轉移蛋白質至PVDF膜。用5% BSA封閉室溫蛋白質，2 h后加入一抗(Ki67，1∶1 100；PCNA，1∶1 000；Bax，1∶1 000；Bcl-2，1∶1 000；PTEN，1∶1 000)4℃封閉過夜。第2天用TBST洗去一抗，加入對應二抗室溫封閉1 h后，滴加化學發光顯色液進行曝光顯影。

2 結果

2.1蛇床子素對肝癌細胞增殖的影響 為了探究蛇床子素的安全用藥濃度，我們檢測了蛇床子素對正常肝細胞L02活性的影響。實驗結果表明，當蛇床子濃度達到200 μmol/L 及以上時，L02活性明顯降至80%以下(表1)，因此選擇50 μmol/L、100 μmol/L和150 μmol/L三個濃度進行后續實驗。 100 μmol/L的蛇床子素作用4 d和5 d可明顯降低肝癌細胞增殖倍數(P<0.05，圖1)；150 μmol/L蛇床子素作用3、4和5 d也能明顯降低肝癌細胞增殖倍數(P<0.05，P<0.01，圖1)；同時，與0 μmol/L組比較，100 μmol/L組和150 μmol/L組細胞增殖標記蛋白Ki67和PCNA表達水平顯著降低(P<0.05，P<0.01，圖2)，且均體現量效關系。

表1 蛇床子素對正常肝細胞活性的影響

圖1 蛇床子素對肝癌細胞活性影響Fig.1 Effect of osthole on cell viability of hepatoma carcinoma cells(HCC)Note: Cells were divided into 0 μmol/L，50 μmol/L，100 μmol/L and 150 μmol/L group and treated with osthole for different times，CCK8 assay was performed for cell viability.n=6，*.P<0.05，**.P<0.01 vs 0 μmol/L group；#.P<0.05 vs 150 μmol/L group.

圖2 蛇床子素對肝癌細胞增殖標記蛋白表達的影響Fig.2 Effect of osthole on expressions of proliferation-related proteins of HCCNote: The protein levels of Ki67 and PCNA were measured by Western blot.n=6，*.P<0.05，**.P<0.01 vs 0 μmol/L group.

圖3 蛇床子素對肝癌細胞凋亡的影響Fig.3 Effect of osthole of cell apoptosis of HCCNote: Cell apoptosis was determined by flow cytometry.n=6，*.P<0.05，**.P<0.01 vs 0 μmol/L group.

2.2蛇床子素對肝癌細胞凋亡的影響 實驗結果表明，與0 μmol/L組比較，100 μmol/L組和150 μmol/L 組細胞凋亡率明顯升高(P<0.05，P<0.01，圖3)，表明蛇床子素可促進肝癌細胞凋亡；同時，100 μmol/L組和150 μmol/L組細胞凋亡標記蛋白Bax的表達水平較0 μmol/L組比較明顯升高(P<0.05，P<0.01，圖4)，Bcl-2表達水平明顯降低(P<0.05，P<0.01，圖4)，且具有量效關系，差異具有統計學意義。

圖4 蛇床子素對肝癌細胞凋亡標記蛋白表達的影響Fig.4 Effect of osthole on expressions of apoptosis-related proteins in HCCNote: The protein levels of Bax and Bcl-2 were determined by Western blot，GAPDH was used as loading control.n=6，*.P<0.05，**.P<0.01 vs 0 μmol/L group.

圖5 蛇床子素對肝癌細胞PTEN表達的影響Fig.5 Effect of osthole on expression of PTENNote: The expression of PTNE was determined by Western blot，GAPDH was used as loading control.n=6，*.P<0.05，**.P<0.01 vs 0 μmol/L group.

2.3蛇床子素對PTEN表達的影響 Western blot實驗結果表明，蛇床子素濃度為100 μmol/L和150 μmol/L時能顯著促進抑癌基因PTEN的表達(P<0.05，P<0.01，圖5)，且具有量效關系，差異具有統計學意義。

2.4下調PTEN表達對蛇床子素抑制肝癌細胞增殖及促細胞凋亡作用的影響 為了探究蛇床子素抑制肝癌細胞增殖作用和促肝癌細胞凋亡作用與PTEN的關系，我們用PTEN抑制劑bpV(HOpic)下調PTEN表達并檢測細胞增殖和細胞凋亡情況。與0 μmol/L組比較，蛇床子素作用3 d、4 d和5 d后，150 μmol/L組細胞增殖倍數明顯降低(P<0.05，P<0.01，圖6)；與150 μmol/L組比較，150 μmol/L+bpV(HOpic)組細胞增殖倍數顯著升高(P<0.05，圖6)，差異具有統計學意義。此外，bpV(HOpic)能明顯減弱蛇床子素對細胞凋亡的促進作用(P<0.05，圖7)。

圖6 bpV(HOpic)對蛇床子素抑制細胞增殖作用的影響。Fig.6 Effect of bpV(HOpic)on effect of osthole on cell proliferationNote: Cells was divided into 0 μmol/L，150 μmol/L and 150 μmol/L + bpV(HOpic)group and treated with osthole and bpV(HOpic).Cell viability was detected by CCK8 assay.n=6，*.P<0.05，**.P<0.01 vs 0 μmol/L group;#.P<0.05 vs 150 μmol/L group.

圖7 bpV(HOpic)對蛇床子素促細胞凋亡作用的影響Fig.7 Effect of bpV(HOpic)on promotive effect of osthole on apoptosisNote: Flow cytometry was performed for cell apoptosis.n=6，**.P<0.01 vs 0 μmol/L group；#.P<0.05 vs 150 μmol/L group.

3 討論

肝癌是最常見的惡性腫瘤之一，并且傳統的化療和放療對于肝癌的治療收效甚微[20]，因此，尋找新的藥物及治療方法是改善肝癌患者預后的關鍵。蛇床子素是從傘科植物蛇床子果實中提取的一類香豆素衍生物，具有多種藥理學活性[21，22]。研究表明，蛇床子素可通過誘導細胞周期阻滯和細胞凋亡抑制乳腺癌細胞增殖，還可通過調控PI3K/Akt信號通路抑制膠質瘤細胞發生上皮間質轉化，從而抑制膠質瘤細胞轉移[12，23]。Lin等[6]研究發現，蛇床子素還能誘導多種肝癌細胞發生G2/M期細胞周期阻滯和DNA損傷，從而促進肝癌細胞凋亡，抑制肝癌細胞增殖。蛇床子素還可通過增加肝癌小鼠CD8+T細胞和CD4+T細胞的數量增強肝癌小鼠自身的抗癌免疫力，提高肝癌小鼠存活率[24]。在本研究中，用不同濃度蛇床子素處理肝癌細胞HepG2后發現，蛇床子素能夠顯著抑制肝癌細胞活性，即抑制肝癌細胞的增殖，并且體現出時間和劑量依賴性。用不同濃度蛇床子素處理肝癌細胞48 h后發現，蛇床子素濃度達到100 μmol/L和150 μmol/L時能明顯降低細胞增殖標記蛋白Ki67和PCNA的表達，提示蛇床子素能通過下調Ki67和PCNA的表達抑制肝癌細胞增殖。此外，蛇床子素還能誘導肝癌細胞凋亡，并隨濃度升高作用逐漸增強。蛇床子素還能促進Bax表達，降低Bcl-2蛋白表達水平。Bax是一類凋亡誘導蛋白，Bcl-2能抑制凋亡的發生，其在多種癌癥中均呈高表達狀態[25-27]。提示蛇床子素能誘導肝癌細胞凋亡，可能從而減緩肝癌的發展。

研究表明，蛇床子素對肝癌細胞的抑制作用與多種細胞機制有關，如調控肝癌細胞的細胞周期，誘導DNA損傷和調控脂質代謝等[6，28]。也有研究表明，蛇床子素調控細胞周期及細胞增殖、凋亡與PI3K/Akt信號通路密切相關[29，30]。據報道，PTEN是PI3K/Akt信號通路的上游調控因子，PTEN過表達可抑制PI3K/Akt信號通路激活抑制癌癥發生和癌細胞生長[31，32]。PTEN是一類抑癌基因，其可通過調控細胞增殖、凋亡、遷移、細胞周期等影響癌癥的發展[33]。并且PTEN表達的下調還與乳腺癌、前列腺癌等化療抵抗性的形成有關[19，34]。Lu等[15]研究發現，蛇床子素可抑制骨肉瘤細胞MG-63 和SAOS-2 PTEN的表達，從而通過抑制PI3K/Akt信號通路激活抑制癌細胞增殖和遷移。并且肝癌細胞PTEN的表達與肝癌發生風險密切相關[35]。PTEN過表達能誘導肝癌細胞凋亡[16，36]，但蛇床子素對肝癌細胞抑癌基因PTEN表達的影響還未見報道。本文研究結果表明，蛇床子素能明顯促進肝癌細胞PTEN的表達，提示蛇床子素抑制肝癌細胞增殖、促進細胞凋亡可能與其誘導PTEN表達有關。進一步研究發現，用bpV(HOpic)抑制PTEN表達后，蛇床子素對肝癌細胞增殖的抑制作用和對細胞凋亡的誘導作用明顯減弱，進一步證明蛇床子素對肝癌細胞增殖和凋亡的調控作用與其誘導PTEN表達有關。

綜上所述，蛇床子素能夠抑制肝癌細胞增殖、促進肝癌細胞凋亡，從而發揮抗肝癌作用，并且其機制與上調抑癌基因PTEN的表達有關。本研究進一步闡明了蛇床子素抗肝癌作用的作用機制，為蛇床子素應用于肝癌的治療提供了新的實驗依據。