紫草素抑制非小細胞肺癌A549侵襲和遷移能力①

張小方 趙 影 李 琦

(河南省駐馬店黃淮學院，駐馬店 463000)

肺癌給人類健康造成了嚴重的威脅，根據組織學特性可分為兩種亞型：小細胞肺癌(Small cell lung cancer,SCLC)和非小細胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)。NSCLC是肺癌的主要亞型，占肺癌病例的85%～90%[1]。目前NSCLC的治療主要包括手術切除、化學治療、放療及免疫治療[1-3]。對不同時期的NSCLC需要不同的治療策略[4]。早期NSCLC主要采用手術切除進行治療(68%)，其中16%的患者手術的同時需要輔助化療或放療，約18%和15%的NSCLC晚期患者分別采用化療和放療，有33%的NSCLC晚期患者需要進行放化療[5]。化學療法在NSCLC的治療過程中占據著重要的位置。中草藥由于其副作用小而被廣泛運用于化學治療。紫草素是紫草的主要活性成分，結構式見圖1A，屬于萘醌類物質。紫草素具有抗炎、抗癌、抗氧化、神經保護、心臟保護、抗菌及傷口愈合等作用，已在多種疾病中報道，例如關節炎、哮喘、狼瘡性腎炎、急性肺損傷、黑色素瘤、神經膠質瘤、宮頸癌、結腸癌、肝癌等[6]。本文主要探索紫草素對NSCLC細胞A549運動能力的影響及其調控機制。

1 材料與方法

1.1細胞系及主要試劑 肺癌細胞系A549(ATCC號：CCL-185)購自美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)。紫草素購自Sigma公司，溶解于二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)。培養基DMEM、胎牛血清購自賽默飛世爾科技公司。CCK-8試劑盒購自日本同仁化學公司。Transwell小室及人工基底膜購自美國BD公司。血管內皮細胞生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)、基質金屬蛋白酶14(Matrix metalloprotein 14,MMP-14)、纖維連接蛋白(Fibronectin,FN)、波形蛋白Vimentin、PI3K、p-AKT和p53抗體購自Abcam公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養及細胞活力檢測 A549細胞于含10%胎牛血清和1%青-鏈霉素的DMEM培養基中，置于37℃、5% CO2的恒溫培養箱中培養。細胞增殖到約80%時傳代繼續培養。首先用培養液將紫草素稀釋到0.5、1、2、5、10、20、50、100、200、400 mmol/L，再用上述含不同濃度紫草素的培養液將細胞制成5×104個/ml的細胞懸液。然后向96孔板中接種100 μl上述細胞懸液，對照孔用添加DMSO的培養液制成的細胞懸液，每個濃度接種5個孔。培養24 h向各孔加入10 μl的CCK-8溶液，并在37℃培養1～4 h，檢測450 nm處吸光值計算細胞活力。

1.2.2Transwell檢測細胞侵襲能力 用添加了DMSO或不同濃度的紫草素的1%胎牛血清的DMEM培養基將A549細胞制成細胞密度為1×106cells/ml的細胞懸液，首先在Transwell下室中加入含20%胎牛血清的DMEM培養基，然后將上述細胞懸液加入鋪有人工基底膜的Transwell的上室中，37℃培養24 h。最后用0.5%的結晶紫對上室底部細胞進行染色，并用棉簽將上室內側的細胞除去。顯微鏡下觀察細胞并統計每個視野下的細胞數量。

1.2.3劃痕實驗檢測細胞遷移能力 首先將A549細胞接種于6孔板中，過夜培養至形成單層細胞。在單層細胞上用10 μl的槍頭劃橫線，PBS洗3次，洗去因劃痕而脫落的細胞后加入添加了DMSO或不同濃度的紫草素的完全培養基置于37℃培養。在0 h和24 h時顯微鏡下拍照測量劃痕寬度計算劃痕愈合率。

1.2.4蛋白印跡 收集各組A549細胞用PBS清洗3次，再用含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液進行裂解提取總蛋白。然后進行SDS-PAGE凝膠電泳分離并轉至PVDF膜。經5%的BSA進行封閉后依次孵育相應的一抗和二抗。最后進行顯色并統計灰度值計算相對表達量。

1.3統計學分析 用SPSS16.0軟件對實驗數據進行統計學分析，兩兩比較用獨立的t檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1紫草素對NSCLC細胞A549細胞活力的影響 通過CCK-8分析不同濃度(0.5～400 mmol/L)的紫草素對NSCLC細胞A549細胞活力的影響。如圖1B所示，用低濃度的(0～10 mmol/L)的紫草素處理A549后，細胞活力仍然可以保持90%以上。高濃度的(100～400 mmol/L)的紫草素會導致A549細胞活力下降，且A549細胞活力會隨著紫草素濃度的升高而降低。上述結果表明，紫草素可減弱NSCLC細胞A549細胞活力，后續實驗采用20、50、100 mmol/L作為低中高三組處理組。

2.2紫草素對NSCLC細胞A549侵襲能力的影響 利用Transwell檢測NSCLC細胞A549侵襲能力。圖2A顯示，紫草素處理A549后，穿過Transwell小室基底膜的細胞數目明顯變少。由圖2B可知，紫草素(20、50、100 mmol/L)組每個視野下的侵襲細胞數目明顯少于對照組(P<0.05)。由此可見，紫草素可減弱NSCLC細胞A549細胞侵襲能力。

2.3紫草素對NSCLC細胞A549遷移能力的影響 通過劃痕試驗分析紫草素對NSCLC細胞A549細胞遷移能力的影響。如圖3A所示，劃線24 h后，紫草素組劃痕間距明顯大于對照組。由圖3B可知，與對照組相比，紫草素(20、50、100 mmol/L)組劃痕愈合率明顯降低(P<0.05)。以上結果表明，紫草素可減弱NSCLC細胞A549細胞遷移能力。

2.4紫草素對NSCLC細胞A549上皮間質轉化的影響 為了分析紫草素對NSCLC細胞A549上皮間質轉化的影響，蛋白印跡檢測上皮間質轉化相關蛋白VEGF、MMP-14、Fn和Vimentin的表達。圖4A顯示，添加紫草素后A549細胞VEGF、MMP-14、Fn和Vimentin表達明顯減弱。統計灰度值計算相對蛋白表達量，如圖4B所示，A549細胞VEGF的表達會隨著紫草素濃度的增加而減弱；紫草素組(20、50、100 mmol/L)MMP-14、Fn和Vimentin的表達也都低于對照組(P<0.05)。由此可見，紫草素可抑制NSCLC細胞A549上皮間質轉化。

圖1 紫草素化學結構式(A)和CCK-8檢測A549細胞活力(B)Fig.1 Chemical structure of shikonin(A)and cell viability was tested by CCK-8(B)

圖2 Transwell檢測細胞侵襲Fig.2 Cell invasion was detected by TranswellNote: A.Crystal violet staining ×100；B.The statistical histogram of the number of invasive cells per field,*.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.001 vs DMSO.

圖3 劃痕試驗檢測細胞遷移能力Fig.3 Cell migration was measured by wound healing assayNote: A.Scratch space was photographed under inverted microscope ×40;B.The statistical histogram of the wound closure rate,*.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.001 vs DMSO.

2.5紫草素對NSCLC細胞A549中PI3K/AKT信號通路的影響 為探索紫草素影響NSCLC細胞A549的分子機制，蛋白印跡檢測PI3K/AKT信號通路蛋白及抑癌基因p53的表達。圖5A顯示，添加PI3K/AKT通路激活劑IGF-1后，PI3K和p-AKT表達升高，p53表達降低；紫草素處理A549后，PI3K和p-AKT表達降低，p53表達升高。由圖5B可知，PI3K/AKT通路激活劑IGF-1可增強PI3K和p-AKT表達，降低p53表達(P<0.05)。與IGF-1組相比，紫草素組(20、50、100 mmol/L)PI3K和p-AKT表達降低，p53表達升高，逆轉IGF-1誘導的PI3K/AKT信號通路的激活和p53表達的降低(P<0.05)。上述結果表明，紫草素可通過PI3K/AKT信號通路對A549進行調控。

圖4 蛋白印跡檢測上皮間質轉化相關蛋白表達Fig.4 Expression of epithelial-mesenchymal transition related proteins was detected by Western blotNote: A.Representative picture of Western blot；B.The statistical histogram of the Western blot,*.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.001 vs DMSO.

圖5 蛋白印跡分析PI3K/AKT信號通路相關蛋白和p53的表達Fig.5 Expression of PI3K/AKT pathway related proteins and p53 was tested by Western blotNote: A.Representative picture of Western blot；B.The statistical histogram of the Western blot.*.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.001 vs A549 group；##.P<0.01,###.P<0.001 vs IGF group.

3 討論

肺癌一直以來都是發生率和死亡率最高的癌癥。全球肺癌病例從2002年的125萬上升到2012年的180萬，肺癌死亡人數從2002年的118萬增加到2012年的160萬[7,8]。而且肺癌的5年以上存活率十分低，在英國肺癌5年以上存活率僅為16.8%[9]。肺癌嚴重影響患者的生活質量且給衛生保健系統帶來巨大的財政壓力，2010年英國用于肺癌的直接醫療成本約121億美元[10]。開發有效的且副作用小的肺癌治療方法對人類健康事業的發展具有重要意義。植物提取物由于其副作用小而在疾病治療方面受到廣泛關注。

大量文獻報道了植物提取物在抑制癌細胞活力方面起著積極作用。有數據顯示從金鐘柏樹葉中提取的黃酮醇可抑制A549細胞活力[11]。據報道，重樓皂苷處理A549后，細胞活力明顯減弱[12]。有研究發現紫草素可抑制胃癌細胞及人表皮樣癌A431細胞活力[13,14]。Huang等[15]發現紫草素還可抑制神經膠質瘤細胞活力。與前人結果類似，本研究結果顯示，NSCLC細胞A549細胞活力會隨著紫草素處理濃度的增加而降低。

癌細胞的運動能力在癌癥發展進程中具有重要作用。許多植物提取物都可以減弱癌細胞的運動能力。有研究發現銀杏葉提取物和紫蘇醇均可抑制A549細胞侵襲[16,17]。據報道栝樓果實可抑制A549細胞遷移及侵襲[18]。Hao等[19]研究顯示紫草素可減弱卵巢癌細胞侵襲能力。有研究數據顯示紫草素可抑制乳腺癌細胞及結腸直腸癌細胞侵襲和遷移[20,21]。本研究結果表明，紫草素(20、50、100 mmol/L)可明顯減弱NSCLC細胞A549侵襲及遷移能力。

越來越多的文獻表明植物提取物可抑制癌細胞上皮間質轉化。Shi等[22]發現沒食子兒茶素-3-沒食子酸酯可抑制尼古丁誘導的A549細胞上皮間質轉化。有研究發現在甲狀腺癌細胞中，紫草素可減弱皮間質轉化相關蛋白Vimentin及MMP-14的表達，抑制上皮間質轉化[23]。有數據顯示紫草素和替莫唑胺混合物可抑制惡性膠質瘤細胞Vimentin表達[24]。Hsieh等[25]發現紫草素可減弱肺癌細胞HCC827波形蛋白Vimentin的表達。與前人結果一致，本研究表明，紫草素(20、50、100 mmol/L)會降低A549細胞VEGF、MMP-14、Fn和Vimentin表達，抑制上皮間質轉化。

大量數據表明抑制PI3K/AKT信號通路，提高p53水平對癌癥的治療具有積極作用。有研究表明毛梗豨薟草提取物可通過抑制AKT的活化減弱A549細胞活力和侵襲能力[26]。有數據顯示丹參酮可降低NSCLC細胞Glc-82、A549和H460中AKT磷酸化水平，提高p53表達，減弱細胞活力[27]。據報道紫草素可通過PI3K/AKT信號通路抑制胰腺癌細胞活力[28]。Zhang等[29]研究發現紫草素可通過抑制PI3K/AKT信號通路減弱膠質母細胞瘤的侵襲和遷移能力。本研究結果顯示，紫草素(20、50、100 mmol/L)可抑制A549細胞PI3K/AKT通路激活劑IGF-1誘導的PI3K/AKT信號通路的激活和p53表達的降低。

本研究表明，紫草素可減弱A549細胞活力；降低細胞侵襲及遷移能力；減弱VEGF、MMP-14、Fn和Vimentin表達，抑制上皮間質轉化；逆轉PI3K/AKT通路激活劑IGF-1誘導的PI3K和p-AKT表達的升高及p53表達的降低。綜上所述，紫草素可通過PI3K/AKT通路實現對A549細胞侵襲和遷移的抑制作用。下一步計劃進行紫草素抑制NSCLC的體內研究，為發掘新的肺癌治療策略奠定基礎。