不結球白菜游離小孢子培養及植株再生研究

黃天虹 張 婭 梁超凡 侯喜林 李 英

(南京農業大學園藝學院/作物遺傳與種質創新國家重點實驗室/農業部華東地區園藝作物生物學與種質創新重點實驗室,江蘇 南京 210095)

游離小孢子培養(isolated microspore culture,IMC)是在無菌條件下,通過一定的機械操作和脅迫處理,阻斷花蕾小孢子的固有發育途徑,從而轉向孢子體發生途徑,經過誘導和培養,發育成為完整可育植株過程的技術[1]。 不結球白菜(Brassica campestris ssp. chinensis Makino)為異花授粉植物,自交不親和性強,純合較困難,而遺傳穩定的純合品系是植物雜種優勢利用必需的育種材料。 傳統自交育種技術耗時長且成本高[2],而游離小孢子培養可以在1 ～2年內獲得純合的雙單倍體(doubled haploid,DH),縮短了育種周期,為育種工作者提供了性狀優良的品種,擴大了不結球白菜的種質資源,滿足了市場需求[3]。

Licher[4]于1982年首次通過游離小孢子培養在甘藍型油菜(Brassica napus)中獲得了胚狀體。 近年來絕大多數蕓薹屬作物通過游離小孢子培養均已成功培養出小孢子再生植株[5-7]。 與傳統育種技術相比,游離小孢子培養能夠快速獲得雙倍體系,可直接用于培育新品種或作為優良親本間接應用于品種改良[8]。 雙倍體系在育種中不僅能用于快速獲得新品種,還是研究數量性狀遺傳基礎的重要工具,包括復雜性狀的遺傳圖譜,如產量或質量性狀、最具農藝價值的性狀等[9]。 目前游離小孢子培養在蕓薹屬作物育種中已經培育出了許多具有高品質、非生物脅迫耐性及抗病的品種[10-12]。 此外,小孢子培養技術還可以用于轉基因研究[13]、突變體育種[14]、生物化學和生理學研究[15-16]。

游離小孢子培養技術在不結球白菜上雖然已經進行了多年的育種研究和應用[17-22],但尚未形成一個完整高效的體系。 本研究通過比較不同處理下不結球白菜游離小孢子培養的出胚率,探討不結球白菜游離小孢子培養的影響因素,同時對不結球游離小孢子發育及植株再生過程進行觀察和倍性鑒定,以期為不結球白菜游離小孢子培養技術體系的優化提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以20 個基因型的不結球白菜為試驗材料,由南京農業大學園藝學院白菜系統生物學實驗室提供(表1)。 2015年9月,對不結球白菜種子低溫春化處理,并播種于穴盤內,11月中旬定植于江蘇省農業職業技術學院(句容)溫室大棚,植株生長期間同常規溫室管理。 2016年2月,植株開始抽薹現蕾開花,從初花期開始,整個植株的開花期間,都可以選取合適長度的花蕾進行游離小孢子培養。

表1 供體植株編號及基因型Table 1 Donor plant code and genotype

1.2 試驗方法

1.2.1 取樣與觀察 于天氣晴朗的9:00-11:00 對無病蟲害、長勢健壯的植株花蕾進行取樣,為減少環境誤差,每個基因型從不同植株上取樣,花蕾于4℃貯存備用。 將花蕾置于光學顯微鏡下,隨機選取10 個視野觀察小孢子的形態結構,并統計視野內單核晚期的小孢子所占比例。 對花瓣/花藥(petal/anther,P/A)的長度比值進行比較,確定適合的花蕾大小,備用。

1.2.2 游離小孢子培養試驗 參照張振超等[23]的方法,并略作改進。 將采集的花蕾樣本用5.6%次氯酸鈉溶液消毒18 min,無菌水沖洗3 min,并重復操作3次,然后將花蕾轉移到100 mL 小燒杯中,加入2 mL B5 培養基(pH 值6.0),先用玻璃棒輕輕擠壓,然后充分研磨成勻漿,過濾后轉移至50 mL 離心管中,添加B5 培養基至7.5 mL,1 000 r·min-1離心5 min,保留沉淀,并添加B5 培養基至7.5 mL,1 000 r·min-1離心5 min,重復上述操作2 次。 于沉淀中加1/2 NLN 培養基(pH 值6.0)至40 mL,然后加入100 μL 活性炭溶液,最后將小孢子懸浮液分裝至大小為60 mm×15 mm 的無菌塑料培養皿中,每皿4 mL,用Parafilm 膜對培養皿進行封口處理,并進行33℃熱激處理1 d,然后轉移至25℃無菌培養室內進行暗培養。 2 ～3 周后,當透明無污染的培養皿中出現肉眼可見的白色小顆粒時,將其轉入60 r·min-1的搖床振蕩暗培養。 3 ～4 周后統計小孢子胚的數目,計算出胚率。

1.2.3 不同基因型對游離小孢子培養的影響 按照1.2.2 所述方法,對20 個基因型的不結球白菜進行游離小孢子培養,每個處理設3 次重復,每重復培養10個皿,每皿40 個花蕾。 探究不同基因型對不結球白菜胚胎發生的影響。

1.2.4 低溫脅迫處理對游離小孢子培養的影響 選取H1、H18、H19 和H20 4 個具有代表性基因型的不結球白菜并對其進行低溫脅迫處理。 采集到的花蕾經4℃低溫脅迫處理0、1、2 d 后進行游離小孢子培養,培養步驟同1.2.2。 每個處理設3 次重復,每重復培養10 個皿,每皿40 個花蕾。

1.2.5 頭孢噻胯處理對游離小孢子胚胎培養的影響選取H1、H16 和H18 3 個具有代表性基因型的不結球白菜進行試驗。 游離小孢子培養步驟同1.2.2。 最后1 次離心結束后,將游離小孢子分別在添加0(CK)、25、50、100、200 mg·L-1頭孢噻胯的1/2 NLN 培養基中進行懸浮培養試驗。 30 d 后統計游離小孢子胚狀體數量。 每個處理設3 次重復,每重復培養10 個皿,每皿40 個花蕾。

1.2.6 游離小孢子植株再生及倍性鑒定試驗 植株再生培養參照劉環環[22]的方法,并略作改進。 在VS-1 300L-U 超凈工作臺(蘇靜安泰,蘇州)上將發育良好的子葉胚轉移到B5 固體培養基中培養2 ～3 周。 待子葉胚長大至3～4 片真葉,轉入MS 固體培養基中進行生根培養。 在MS 培養基中培養2 ～3 周,待發育為組織分化明顯的小植株時,煉苗后移栽。 利用AccuriTmC6 流式細胞儀(BD 公司,美國)采用倍性測量法[21]鑒定倍性,倍體植株的峰值在220 nm 左右出現,因此在220 nm 左右出現峰值的即為雙倍體。

1.3 數據處理

試驗數據通過Microsoft Excel 2007 軟件進行統計分析,運用SPSS 19.0 進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 不結球白菜游離小孢子發育時期與P/A 之間的關系

由表2 可知,當大多數小孢子處于單核晚期時,不結球白菜的P/A 介于0.8～1.1 之間;當小孢子處于單核中期到晚期的過渡時期時,P/A 大于1.1(圖1-a);當大多數小孢子處于單核晚期時,P/A 為0.85 ～1.1(圖1-b);小孢子接近成熟時,花藥伸長,即將授粉,此時P/A 小于0.85(圖1-c)。 因此,不結球白菜游離小孢子培養取材一般選擇P/A 在0.85 ～1.1 之間的花蕾,此時的花蕾黃中帶綠,是小孢子培養的最佳時期。

圖1 游離小孢子的發育時期Fig.1 The development phase of free microspores

表2 供體植株游離小孢子單核晚期的P/ATable 2 The length ratio of petalslanthers at the late mononuclear stage of isdated microspores of donor plant

2.2 不同基因型對不結球白菜游離小孢子培養胚胎發生的影響

由表3 可知,20 個不結球白菜材料中有10 個基因型誘導出胚,誘導頻率為50%。 此外,10 個品種的出胚率具有顯著差異,出胚率最高的基因型為H20,每10 個花蕾出現胚狀體數7.75,其次是H10,為6.88胚·10 蕾-1。

2.3 低溫脅迫處理對不結球白菜游離小孢子培養胚胎發生的影響

由表4 可知,未經低溫脅迫處理時,4 個基因型均未產生胚狀體;低溫脅迫處理1 d 時游離小孢子的出胚率最高,且不同基因型的小孢子出胚率存在差異,H20 出胚率最高,為7.66 胚·10 蕾-1,其次是H18(7.33 胚·10 蕾-1),H19 出胚率最低,僅0.67 胚·10蕾-1;低溫脅迫處理2 d時僅H1出胚。 綜上表明,4℃低溫脅迫處理對游離小孢子胚胎的發生能力與處理時間和基因型密切相關。

表3 不同基因型對游離小孢子出胚率的影響Table 3 Effect of different genotypes on germination rate of isolated microspores

表4 4℃低溫脅迫處理對游離小孢子出胚率的影響Table 4 Effect of 4℃cold stress on the germination rate of isolated micropores /(胚·10 蕾-1)

2.4 頭孢噻胯對不結球白菜游離小孢子培養胚胎發生的影響

由圖2 可知,游離小孢子出胚率與頭孢噻胯濃度和基因型密切相關,未添加頭孢噻胯時,基因型H18出胚率最高,胚狀體數為17 個,而基因型H1 和H16出胚量極少,分別為0.5 和0 個,添加頭孢噻胯會對基因型H18 中胚胎發生產生抑制作用,對基因型H1 和H16 產生一定的促進作用;添加50 mg·L-1頭孢噻胯時,基因型H1 和H16 的出胚率均最大,胚狀體數分別為4 個和6.5 個。

圖2 頭孢噻胯濃度對游離小孢子培養胚胎發生的影響Fig.2 Effect of cefotaxime concentration on embryogenesis of isolated microspore

2.5 小孢子胚胎發育過程觀察及分析

在倒置顯微鏡下觀察不結球白菜游離小孢子胚胎發育過程,熱激處理1 d 時大多游離小孢子細胞未獲得胚胎發生能力(圖3-a),少數細胞膨大并開始發生對稱分裂(圖3-b);經過一系列的不規則的細胞分裂形成胚胎細胞簇,此時該細胞簇仍由小孢子外壁約束(圖3-c),然后胚胎細胞簇繼續發育形成球形胚(圖3-d);培養7 d 左右時部分存活的小孢子發生多次分裂,最終導致細胞外壁開始破裂(圖3-e),并釋放出帶胚柄的胚胎(圖3-f),觀察到正在進行縱向分裂的多細胞結構(圖3-g);2～3 周后肉眼便可觀察到白色小點,其生長迅速,很快長成子葉胚(圖3-h、i)及愈傷組織(圖3-j)。 隨著培養天數的增加,存活的游離小孢子數量不斷減少,只有少數的游離小孢子(＜5%)成功形成胚狀體。

2.6 游離小孢子胚胎再生能力分析

圖3 小孢子胚胎發育過程Fig.3 Microspore-derived embryo development

經過游離小孢子培養獲得的胚狀體,進行植株再生試驗,由表5 可知,從胚狀體到再生幼苗階段,胚胎再生頻率因基因型不同而存在差異,H6、H15 和H19均在胚狀體階段死亡,未實現幼苗再生;H1、H13、H16、H18 和H20 均實現幼苗再生,但再生頻率差異較大。

2.7 游離小孢子植株倍性鑒定分析

結合植株的形態觀察結果,對游離小孢子植株進行流式細胞儀倍性鑒定分析,由表6 可知,共檢測出21 個雙倍體和2 個單倍體,自然加倍率為91.3%。 其中,H1、H13 和H16 的自然加倍率達到100%;H18 和H20 自然加倍率分別為80%和90%。 綜上表明,不結球白菜的游離小孢子植株自然加倍率較高。

2.8 游離小孢子植株再生過程

對F2材料H20 從游離小孢子胚胎發育到植株再生過程進行持續觀察,結果表明,子葉胚的初始顏色一般為淡黃色(圖4-a),隨著子葉胚的不斷發育,子葉胚開始由淡黃色轉變為綠色,胚軸伸長,并出現根毛(圖4-b)。 繼續觀察發現,部分子葉胚在植株的根部產生愈傷,并褐化死亡(圖4-c),部分子葉胚可直接發育成完整植株,且組織分化完全(圖4-d、e、f)。 對正常發育的植株進行煉苗后,1 個月后將其轉到人工氣候室中培養,可觀察到不同形態的植株(圖4-h);培養6 個月后植株的形態仍各不相同(圖4-i)。

表5 游離小孢子胚胎植株再生狀況Table 5 The condition of plant regeneration of microspore-derived embryos

表6 不結球白菜游離小孢子胚胎植株倍性鑒定Table 6 Ploidy identification of regeneration plant of microspore-derived embryos in non-heading Chinese cabbage

3 討論

大量研究表明,基因型和發育時期是影響游離小孢子胚胎發生的主要因素[24-28],如不結球白菜大部分基因型出胚率均小于5 胚·蕾-1[22,29-30],甘藍型油菜品種浙雙758 和浙雙72 出胚率能達到60 ～70胚·蕾-1[13], 花 椰 菜 品 種 xiaxue40 能 達 到 178胚·蕾-1[25],大白菜能達到42.4 胚·蕾-1[31],本試驗中的20 個不同基因型的不結球白菜中僅10 個成功誘導出胚,且整體出胚率不高,最大的出胚率為7.75 胚·10蕾-1,與其他十字花科蔬菜相比,不結球白菜出胚率較少,且基因型對小孢子培養誘導效果起決定作用。 發育時期也是影響游離小孢子培養出胚率的關鍵因素,一般處于單核晚期至雙核早期的游離小孢子較容易激發配子體胚胎發生能力,從而獲得胚胎甚至完整植株。但是同一物種內基因型、生長環境等都會影響花蕾的大小,有的花蕾很小,可能已經進入雙核晚期,但P/A則不會因為環境變化發生太大的改變,相對選擇花蕾大小來說,比較可靠[28]。 本研究發現當P/A 介于0.85～1.10 時,小孢子主要處于單核晚期,此時是游離小孢子培養誘導胚胎發生的最佳階段。

影響游離小孢子胚胎發生的因素有很多,如低溫預處理[20-22]、蔗糖濃度[21]、小孢子培養密度[24]、培養基的組成[25-26],本研究發現4℃低溫脅迫處理和頭孢噻胯也會影響游離小孢子胚胎發生。 4℃低溫脅迫處理1 d 時,出胚率最高,這可能是因為低溫延遲了所采集花蕾的生長,并使其保持在一個較高的活性狀態[2]。 頭孢噻胯是一種抗生素,其對真核生物毒性較低,但對微生物有殺菌作用,此外,還具有類似于生長素的活性,可以促進體細胞胚胎發生及植株再生[32-34]。 本研究結果表明,H1 和H16 中1/2 NLN 培養基添加50 mg·L-1頭孢噻胯對其胚的誘導效果最好,這與Ahmadi 等[35]和曾愛松等[36]的研究結果一致。但在H18 中未添加頭孢噻胯的處理出胚率最高,表明頭孢噻胯對不結球白菜游離小孢子胚胎發生的影響與基因型相關。

圖4 H20 游離小孢子植株再生過程Fig.4 The regeneration of microspore-derived plant of H20

游離小孢子培養發育成長形成的胚狀體,在形成完整可育的植株之前還需要經歷再生培養及植株移栽過程,因為游離小孢子為花粉未成熟的配子體,經歷胚胎發生后可能會產生加倍。 目前,有關游離小孢子培養植株的加倍的研究較多,如毛忠良等[28]對羽衣甘藍游離小孢子植株進行秋水仙堿處理,并結合流式細胞儀倍性鑒定,發現其加倍率達到78.4%,提高了游離小孢子培養技術的利用率;成妍等[29]通過對不結球白菜暑綠和黃幫小孢子植株進行倍性鑒定,發現暑綠的自然加倍率達到90%,而黃幫的自然加倍率為62%,說明基因型不同,其自然加倍率也不同;袁素霞等[37]通過研究細胞倍性與氣孔保衛細胞葉綠體數的相關性,提供了一種簡便經濟的倍性鑒定方法;王玉書等[38]研究發現觀賞羽衣甘藍中不同基因型倍性變異具有差異性,鑒定結果表明單倍體、二倍體和四倍體同時存在。 本試驗通過流式細胞儀對所獲得的游離小孢子植株進行倍性鑒定,共檢測出21 個雙倍體和2 個單倍體,自然加倍率為91.3%。 但不結球白菜的自然加倍率較高的原因尚不清楚,有待進一步更深入的研究。

4 結論

本試驗結果表明,基因型是影響小孢子培養的出胚率和其后的植株再生的關鍵因素。 當P/A 為0.85～1.10 時,不結球白菜小孢子主要處于單核晚期;4℃低溫脅迫處理1 d 時出胚率較高,頭孢噻胯對出胚率的影響與基因型相關,不結球白菜植株自然加倍率較高,為91.3%。 頭孢噻胯對小孢子培養具有基因特異性相一致,但由于本試驗出胚率較少,僅能對今后的不結球白菜游離小孢子培養提供參考價值。