羊種布魯氏菌OMP16蛋白結構的生物信息學分析

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布魯氏菌常導致家畜感染，進而感染人類引起布魯氏菌病，以羊種布魯菌為主[1]。全球每年新發布病約50萬例[2]，布病臨床癥狀不典型，慢性化率高，長期不愈并累多關節臟器，使患者反復遭受疾病折磨[3-4]，給很多國家的人類健康和經濟發展造成巨大的傷害[5-6]。研發針對布魯氏菌的疫苗可以有效減少布病的發病，但目前的滅活疫苗和減毒活疫苗還存在效果不佳和不良反應多等不足[7]。OMP16蛋白是布魯氏菌的一種外膜蛋白，具有很好的免疫原性，本研究利用生物信息學分析手段，對OMP16蛋白進行理化性質及結構進行分析，預測可能的B和T細胞的優勢抗原表位，為布魯氏菌診斷和疫苗研究的提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1氨基酸序列 從NCBI網站中的protein(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/)中獲取B.melitensis的OMP16蛋白的氨基酸序列(GenBank: AAD33089.2)，序列如下：Mgyfpswrltsnavvlpderlpaaaavpmgiqhllamsgstivapllmgfdpnvavffsgig-tllfflitagrvpsylgssfafiavviaatgysgsgpnpniaialggiiac-galysliglivmflgtgwveklmppavtgaigvsiglnlapvaigqlk-gtgahtsialltvlcmamisaygprgtrrlsvlfallfgyllvliagngl-givpgidftavknaawfglphfttpafnwqavtliapvaivlvaenlg-hikalgsitgrnmdgyigrgffsdglatmisgagggtgvttyaenig-vmamtkvystlifviaaimalilgmspkfgailqtipapvlaglavsv-fgliasamariwivnkvdfadsrnlftvgvalifgagdftlnignfalg-giatstlaalvlyqllgigrsds

1.1.2生物信息學分析軟件 蛋白理化分析：ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)；二級結構分析：DNAstar 7.2軟件的Protein模塊，SOMPA在線分析軟件(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)；三級結構分析：Phyre2在線分析(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html)； Rasmol 2.7.2.1；T和B表位分析：IEDB(http://tools.immuneepitope.org/mhci/)、(http://tools.immuneepitope.org/mhcii/)、(http://tools.immuneepitope.org/main/bcell/)、SYFPEITHI (http://www.syfpeithi.de/bin/mhcserver.dll/epitopeprediction.htm)、ABCpred Prediction(http://www.imtech.res.in/raghava/abcpred/)、BepiPred 1.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred/)、DNAstar 7.2。

1.2 方 法

1.2.1利用ProtParam進行OMP16蛋白理化性質預測 分析蛋白的氨基酸組成、分子量、理論等電點、不穩定系數和疏水性等理化性質。

1.2.2利用DNAstar軟件Protein模塊和SOMPA分析OMP16蛋白質二級結構 采用Gramier-Robson和Chou-Fasman方法預測OMP16蛋白α螺旋，β折疊，β轉角和無規卷曲的二級結構特點。

1.2.3利用Phyre2和Rasmol蛋白質三級結構分析 將OMP16氨基酸序列錄入Phyre2在線服務器，分析蛋白氨基酸序列并組合模板，構建OMP16蛋白的三級結構并生成pdb數據文件，用Rasmol軟件讀取數據文件并對三級結構進行分析。

1.2.4B和T表位預測分析 利用IEDB、DNAStar、ABCpred和BepiPred預測OMP16蛋白的B細胞抗原表位；利用SYFPEITHI和IEDB進行OMP16蛋白的T抗原表位預測。MHC-I(The major histocompatibility complex class-I)分子選擇HLA-A*1101，MHC-II分子選擇HLA-DRB1*0701進行預測。通過比較分析最終OMP16蛋白的B細胞及T細胞優勢抗原表位。

2 結 果

2.1理化性質 ProtParam顯示OMP16蛋白有426個氨基酸序列，蛋白分子質量為43678.81 Daltons；理論等電點為9.72；原子組成為C2026H3209 N499O536S17；不穩定系數為26.57，歸類為穩定蛋白；平均親水系數GRAVY：0.981，歸類為疏水性蛋白。

2.2二級結構 經DNAstar軟件分析OMP16蛋白的二級結構結果見圖1。OMP16蛋白的α-螺旋，β-折疊，β-轉角和無規則卷曲的具體區域位置見表1。

SOPMA服務器在線分析OMP16二級結構檢測顯示：α-螺旋40.61%，β-折疊19.01%，β-轉角8.45%，無規則卷曲31.92%。結構見圖2。

2.3三級結構 為了直觀的分析蛋白質的構象結構，利用Phyre2服務器在線分析OMP16蛋白的三級結構，分析發現構建的蛋白序列覆蓋率為92%，可信度達到100.0%。建模后，通過RasMol軟件分析預測OMP16蛋白的三級結構。結果顯示OMP16蛋白結構成環狀，結構穩定，有較多的β-折疊位于蛋白質的中部。上下部有很多易于形成構象抗原表位的結構。結果見圖3。

圖1 DNAStar分析OMP16蛋白的二級結構結果Fig.1 Secondary structure prediction results for the OMP16 protein by DNAStar

表1 DNAStar分析OMP16蛋白的二級結構結果
Tab.1 Secondary structure prediction results for the OMP16 protein by DNAStar

方法α-螺旋β-折疊β-轉角無規則卷曲arnier-Robson18-33,170-177,221-226,254-263,303-315,320-328,356-366,373-37711-16,40-47,53-60,64-70,86-93,103-127,141-160,188-197,211-220,263-281,336-356,378-389,415-42136-39,59-62,71-73, 94-96,185-187,207-209,232-23461-64,97-101,128-130,163-164,183-185,234-236,292-297Chou-Fasman16-27,32-36,133-137,150-153,218-228,257-26440-44,54-69,83-92,104-127,137-148,165-180,188-205,211-222,239-255,264-269,295-330,336-359,361-372,378-387,402-4214-7,10-13,27-31,37-41,51-54,70-77,79-82,94-97,99-102,128-131,162-165,184-187,206-210,270-274,276-284,291-294,332-335,374-378,388-392,395-399,422-426

2.4 B和T細胞表位

2.4.1B細胞表位的預測 IEDB在線表位預測軟件結果(圖4)顯示：線性表位由高到低分別是263-307，1-30，210-228，332-348，91-105，130-145(圖4A)。β-轉角由高到低分別是92-103，290-299，72-82，265-285，181-190，159-167,182-190(圖4B)。表面可及性由高到低分別，182-191，16-22，297-303，92-102，267-273，309-314，369-379，3-11(圖4C)。可塑性由高到低分別為92-102，290-305，183-191，158-168，37-42，372-379，16-21(圖4D)。抗原性由高到低依次為243-256,191-206,410-419,151-158,83-91,339-358,314-327,106-126(圖4E)。親水性由高到低依次是91-103，284-306，265-277，159-168，181-191，369-380，72-80，8-23(圖4F)。

利用BepiPred 1.0b Server和ABCpred Prediction Server預測分析B細胞表位，尋找共同預測的表位，結果見表2。然后結合IEDB和DNAStar顯示的OMP16外模蛋白結構的線性表位，β-轉角，親水性，可塑性和表面可及性的特點，最終確定B細胞表位。

圖2 SOPMA分析OMP16蛋白的二級結構結果Fig.2 Secondary structure of OMP16 protein predicted by SOPMA

注：OMP16蛋白的三級結構由Phyre構建，其中紅色為α-螺旋，黃色為β-折疊，藍色為無規則卷曲，其他為白色。Cartoons模式(A)圖為正面，(B)圖為背面；Stick模式(C)圖為正面，(D)圖為背面；Spacefill模式(E)圖為正面，(F)圖為背面。圖3 OMP16三級結構預測結果Fig.3 Tertiary structure prediction results for the OMP16 protein

A：線性表位；B：β-轉角 ；C：表面可及性；D：可塑性；E：抗原性；F：親水性圖4 IEDB分析預測結果Fig.4 Result of IEDB prediction

表2 BepiPred和ABCpred預測的B細胞表位結果
Tab.2 Results of B cell epitopes predicted by BepiPred and ABCpred

BepiPred 1.0b ServerABCpred Prediction Server 位置序列得分位置序列得分19-24ERLPAA0.9639-55GSTIVAPLLMGFDPNV0.9693-102GYSGSGPNPN2.2786-102AVVIAATGYSGSGPNP0.95137-143PPAVTGA0.72326-342ALILGMSPKFGAILQT0.9160-166LKGTGAH0.84273-289DGYIGRGFFSDGLATM0.9183-187YGPRGT1.20177-193MAMISAYGPRGTRRLS0.88269-275GRNMDGY0.44139-155AVTGAIGVSIGLNLAP0.88290-301SGAGGGTGVTT1.58294-310GGTGVTTYAENIGVMA0.85

2.4.2T細胞表位預測 利用SYFPEITHI和IEDB在線表位預測軟件，HLA等位基因選擇HLA-A*1101預測分析CTL細胞表位，選擇HLA-DRB1*0701挑選重疊預測的Th表位。結果見表3。

2.4.3經過篩選和比較最終確定了4個B細胞的優勢表位，5個CTL和5個Th細胞優勢表位，結果見表4。

表3 SYFPEITHI和IEDB預測的T細胞表位結果
Tab.3 Results of T cell epitopes predicted by SYFPEITHI and IEDB

表位SYFPEITHIIEDB位置序列分數位置序列百分位等級CTL表位408STLAALVLY23281FSDGLATMI0.369ITAGRVPSY2258FSGIGTLLF0.45267ITGRNMDGY21408STLAALVLY0.65193VLFALLFGY18267ITGRNMDGY0.65293GGGTGVTTY17373FADSRNLFT0.786AVVIAATGY16191LSVLFALLF0.75109GIIACGALY1669ITAGRVPSY0.8175LCMAMISAY16380FTVGVALIF1.25373FADSRNLFT13175LCMAMISAY1.3Th表位4FPSWRLTSNAVVLPD32316TLIFVIAAIMALILG0.2232QHLLAMSGSTIVAPL3061IGTLLFFLITAGRVP0.25352VSVFGLIASAMARIW28310MTKVYSTLIFVIAAI0.26180ISAYGPRGTRRLSVL2662GTLLFFLITAGRVPS0.463TLLFFLITAGRVPSY2429MGIQHLLAMSGSTIV0.5974VPSYLGSSFAFIAVV24311TKVYSTLIFVIAAIM0.61121GLIVMFLGTGWVEKL2463TLLFFLITAGRVPSY0.66307VMAMTKVYSTLIFVI243YFPSWRLTSNAVVLP0.76316TLIFVIAAIMALILG2430GIQHLLAMSGSTIVA0.81

表4 B和T細胞優勢表位
Tab. 4 B and T cell dominance epitopes

表位方法位置序列B細胞表位ABCpred93-102GYSGSGPNPNBepiPred183-187YGPRGTIEDB294-301GGTGVTTYDNAstar273-289DGYIGRGFFSDGLATMCTL細胞表位69-77ITAGRVPSY175-183LCMAMISAYSYFPEITHI267-275ITGRNMDGYIEDB373-381FADSRNLFT408-416STLAALVLYTh細胞表位4-20FPSWRLTSNAVVLPD32-46QHLLAMSGSTIVAPLSYFPEITHI63-77 TLLFFLITAGRVPSYIEDB316-330TLIFVIAAIMALILG352-366VSVFGLIASAMARIW

3 討 論

布魯氏菌病是全球很常見的人獸共患病，有160多個國家和地區受到布病的威脅。布魯氏菌有10個種，造成人感染的主要是羊種、牛種和豬種布魯氏菌，而羊種引起布魯氏菌病最為常見[1,8]。感染布魯氏菌后可引起波浪形發熱并造成各種關節臟器損害，包括關節炎，脊椎炎，骶髂關節炎，心內膜炎和神經系統并發癥。由于布魯氏菌缺乏外毒素、菌毛等良好抗原表位，LPS也表現為低反應性。這些特點使布魯氏菌發生了免疫逃避，并在宿主細胞中存活以建立持久感染[9]。布魯氏菌疫苗這一很好的控制手段由于存在安全性等問題，還需要進行深入的研究[10]。

布魯氏菌細胞膜有3層，OMP16位于細胞膜外側，是外膜結構中必不可少的成分。與OMP10和OMP19屬于第一組外膜蛋白[11]。根據之前的研究認為OMP16具有很強的免疫原性，可以激活TLR4-MyD88信息轉導通路，刺激機體產生足夠強度的免疫應答[12-13]。與傳統的實驗方法進行表位預測相比，生物信息學技術使蛋白結構分析和表位的預測變得更加高效和準確[14]，目前已成為很多表位和疫苗研究首選方法[15-16]，也常用于布魯氏菌表位預測和疫苗的研制[17]。本研究使用多個軟件對OMP16蛋白進行多角度的分析，分析結果顯示OMP16蛋白總體是一個結構穩定的疏水性蛋白，二級結構中α-螺旋占40.61%，β-折疊占19.01%，β-轉角占8.45%，無規則卷曲占31.92%。Phyre構建的三級結構顯示OMP16蛋白具有多個可以形成表位的空間結構。α-螺旋和β-折疊是位于蛋白內部的剛性結構，較難形成表位，β-轉角區域和無規則卷曲區域是很好的形成抗原表位區域。親水性強、可及性和可塑性較好的區域也是形成表位的優勢區域[18]。OMP16的蛋白結構顯示其具有很好的表位預測價值。

本研究預測的4個B細胞優勢表位均是在BepiPred和ABCpred共同預測表位分數較高的基礎上，結合IEDB和DNAStar預測的親水性等參數，除外在α-螺旋和β-折疊區域的表位，通過選取兩種預測軟件重合的區域最終確定93-102，183-187，273-289，294-301為B細胞優勢表位。其中3個位于無規則卷曲區域，1個位于β-轉角區域。BepiPred軟件通過隱馬爾可夫模型和傾向量表法來預測預測B細胞表位[19]，而ABCpred軟件是通過基于神經網絡的一種預測方法[20]，都具有很較高的預測精度。本次研究著重于線性B細胞表位的預測，因為它們更適用于開發基于肽的疫苗和診斷試劑[21]。

T細胞包括細胞毒性T淋巴細胞(CTL)和輔助性T細胞(Th)。CTL識別內源性抗原，可以與MHC Ⅰ類分子結合，Th細胞識別MHC II類分子。Th細胞通過分化為不同的Th亞群來抵御布魯氏菌，Th1細胞激活并產生IFN-r等細胞因子發揮著關鍵的殺菌作用。同時布魯氏菌是一種胞內感染菌，預測CTL和Th細胞表位均對布魯氏菌清除具有重要意義。本研究使用SYFPEITHI和IEDB進行了分析和比較[22-23]，HLA等位基因選擇新疆地區人群出現頻率較高的HLA-A*1101和HLA-DRB1*0701[24]進行預測，最終篩選出CTL和Th細胞優勢表位各5個。

本研究預測的二級結構和T、B表位均采用多種方式在多個角度進行了分析和預測。T、B表位通過比較分析尋找兩種軟件的重疊區域，有效的規避了單一軟件預測正確率不是很高的缺陷，可以提高預測結果的正確率。總之，我們認為篩選出的OMP16蛋白的B和T細胞優勢表位具有很好的免疫原型，能夠為進一步疫苗開發和布病診斷提供一定的理論基礎。

利益沖突：無