中和白細胞介素17對博來霉素誘導小鼠肺纖維化的干預作用*

宋桂芹，馬立飛，趙鐵軍，張效云

（河北北方學院 1.生物化學教研室，2.生命科學中心，河北 張家口 075000）

肺纖維化是一種慢性、進展性的肺間質性疾病，以彌漫性肺泡炎、成纖維細胞大量病理性增生，以及細胞外異常沉積為主要病理特征。其對人類健康危害極大，近年來發病呈上升趨勢，是大多數間質性肺疾病的最終病理結果。盡管近幾年在闡明肺纖維化的病理生理學方面研究取得了顯著的進展，同時人們也在細胞和分子水平加深了對肺纖維化機制的認識，但是在臨床上仍缺乏有效的治療方法，病死率高，預后極差[1]，因此進一步探索其發病機制和拓展其治療策略具有重要的理論和實際意義。

白細胞介素17（interleukin-17, IL-17）是主要由活化的CD+T細胞亞群TH17細胞生成的炎癥細胞因子[2]。IL-17家族中至少存在6個成員，即IL-17A到IL-17F，其中IL-17A最早被發現且作用最廣泛[3]。IL-17A具有很強的募集粒細胞及促進多種炎癥細胞因子合成并釋放的作用，如IL-6、基質金屬蛋白酶（matrix metallo proteinases, MMPs）等，同時具有協同炎癥因子擴大炎癥效應的作用，與機體的免疫性疾病、炎癥及腫瘤等有關[4]。本研究以博來霉素（Bleomycin,BLM）誘導肺纖維化小鼠為模型，通過檢測中和IL-17A后支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid,BALF）中炎癥細胞和IL-1β、IL-10、IL-17A、γ干擾素（Interferon-γ, IFN-γ）4種細胞因子，以及羥脯氨酸（Hydroxyprine, HYP）、丙二醛（Malonaldehyde,MDA）、活性氧（reactive oxygen species, ROS）含量在肺纖維化過程中的變化來評價中和IL-17A對肺纖維化過程的干預作用，為進一步探索肺纖維化的發生機制及臨床治療提供新的理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

小鼠C57BL/6 96只，SPF/VAF級，雌性，6～8周齡，體重（17±1）g，購自北京大學醫學部，許可證號分別為SCXK-2012-0004和SCXK-2012-0001。標記動物后分籠飼養，溫度18～24℃，光暗周期交替。

1.2 主要藥品與試劑

BLM購自日本化藥株式會社（批號640110），HYP、ROS及MDA試劑盒購自南京建成生物研究所，IL-17A中和抗體和同型抗體IgG2A購自美國R & D System公司，IL-1β、IL-10、IL-17A、IFN-γ酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒購自美國eBioscience公司。

1.3 主要儀器

普通光學顯微鏡、熒光酶標儀、722分光光度計、小鼠固定操作臺、胰島素注射器、直型靜脈滯留針、載玻片均由河北北方學院生物化學教研室提供。

1.4 方法

1.4.1 動物分組 96只實驗小鼠隨機分為4組，分別為抗體干預組、同型抗體對照組（IgG2A組）、博來霉素組（BLM組）、正常對照組（NC組），每組24只。

1.4.2 肺纖維化模型復制及處置 小鼠稱體重后，用3.5%水合氯醛注射液腹腔麻醉（0.1 ml/10 g體重），向抗體干預組、IgG2A組、BLM組小鼠的氣管內注入生理鹽水溶解的BLM（5 mg/kg），向NC組小鼠注入等量生理鹽水。于注射BLM后的第4、9、14、19和22天抗體干預組尾靜脈注射IL-17A中和抗體（400 μg/kg），IgG2A組尾靜脈注射IgG2A抗體（400 μg/kg），BLM組和NC組則給予等量生理鹽水。分別于飼養的第7、14和28天將4組小鼠分批處死，取BALF涂片進行細胞計數；通過試劑盒檢測IL-1β、IL-10、IL-17A、IFN-γ的含量變化；留取肺組織置于液氮-70℃冷凍保存，用于HYP、MDA及ROS含量的檢測。

1.4.3 BALF的制備及涂片 分別于復制模型后第7、14和28天從每組中隨機選取6只小鼠，摘除眼球取血，處死，氣管插管，PBS 1 ml灌洗肺組織2次，輕輕按摩，收獲BALF。將獲得的BALF 在4℃、1 400 r/min離心10 min，分離上清液，用于細胞因子檢測。用100 μl PBS重懸沉淀，充入計數池在光學顯微鏡下計數細胞總數，涂片行瑞氏染色并在油鏡下細胞分類計數，分別計數淋巴細胞、單核細胞、中性粒細胞（＞200個有核細胞 /片）。

1.4.4 BALF中 IL-1β、IL-10、IL-17A、IFN-γ 的測定 按IL-1β、IL-10、IL-17A、IFN-γ ELISA試劑盒說明書進行操作，根據標準曲線計算樣本中IL-1β、IL-10、IL-17A、IFN-γ的含量。

1.4.5 肺組織ROS、HYP及MDA的測定 參照文獻[5]制備10%的肺組織勻漿液，低溫離心取上清液，嚴格按照試劑盒說明書行肺組織ROS、HYP及MDA的測定。

1.4.6 小鼠肺組織病理學評價 復制模型后，第28天處死4組剩余存活小鼠，并分別取右肺下葉于4%多聚甲醛中固定，經脫水、浸蠟和包埋后制作厚度5 μm石蠟切片，行Masson染色，參照SZAPIEL等[6]的方法，在光學顯微鏡下觀察肺組織病理學改變。肺纖維化程度的評定標準：0級，無纖維化；1級，輕度纖維化，且面積＜20%全肺；2級，中度纖維化，且面積占20%～50%全肺；3級，重度纖維化，且面積＞50%全肺，肺泡結構非常紊亂。

1.5 統計學方法

數據分析采用SPSS 16.0統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，各組數據采用重復測量設計的方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠的一般情況

NC組小鼠精神狀態均良好，飲食和飲水正常，體重有不同程度的上升，無小鼠死亡。BLM組、IgG2A組和抗體干預組的小鼠在復制模型后不久即出現活動度下降，精神萎靡，同時出現不同程度的飲食和飲水減少，在復制模型后的第9天，除個別小鼠外，體重又開始回升，并趨于穩定。BLM組在第11天死亡1只，IgG2A組在第13天死亡1只，抗體干預組和NC組無小鼠死亡。

2.2 各組小鼠BALF中細胞總數、中性粒細胞、淋巴細胞以及單核細胞數量的變化情況

各組小鼠BALF中細胞總數比較，采用重復測量設計的方差分析，結果：①各組不同時間點的細胞總數有差異（F=14 790.397，P=0.000）。②各組間BALF中的細胞總數有差異（F=350.258，P=0.000）；其他組中BALF中細胞總數高于NC組（P＜0.05）。IgG2A組和BLM組的細胞總數比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。而抗體干預組、IgG2A組和BLM組的表達高峰在第14天，其中抗體干預組低于IgG2A組和BLM組（P＜0.05）。③各組細胞總數的變化趨勢有差異（F=1 069.935，P=0.000）。見表 1。

各組小鼠BALF中中性粒細胞數比較，采用重復測量設計的方差分析，結果：①各組不同時間點的中性粒細胞計數有差異（F=2 155.813，P=0.000）。②各組間的中性粒細胞計數有差異（F=367.880，P=0.000）；其他組中性粒細胞計數高于NC組，其高峰均在第14天，其中抗體干預組低于IgG2A組和BLM組（P＜0.05）。③各組中性粒細胞計數的變化趨勢有差異（F=229.875，P=0.000）。隨著時間推移，中性粒細胞計數呈逐漸下降趨勢。見表2。

各組小鼠BALF中淋巴細胞計數比較，采用重復測量設計的方差分析，結果：①各組不同時間點的淋巴細胞計數有差異（F=61.430，P=0.000）；②各組間的淋巴細胞計數有差異（F=456.240，P=0.000）；抗體干預組低于IgG2A組和BLM組（P＜0.05）。③各組淋巴細胞計數的變化趨勢有差異（F=29.647，P=0.000）。見表 3。

各組小鼠BALF中單核細胞計數比較，采用重復測量設計的方差分析，結果：①各組不同時間點的單核細胞計數有差異（F=461.806，P=0.000）。②各組間的單核細胞計數有差異（F=137.742，P=0.000）；單核細胞在第14天時達高峰，其中抗體干預組低于IgG2A組和BLM組（P＜0.05）。③各組單核細胞計數的變化趨勢有差異（F=57.197，P=0.000）。見表4。

2.3 BALF中IL-1β、IL-10、IL-17A、IFN-γ的含量比較

各組小鼠BALF中IL-1β的含量比較，采用重復測量設計的方差分析，結果：①各組不同時間點IL-1β的含量有差異（F=9.534，P=0.001）。②各組間IL-1β的含量有差異（F=98.320，P=0.000）；BLM組、IgG2A組及抗體干預組各時間點IL-1β表達量與NC組比較升高（P＜0.05），其表達高峰均在第7天；IgG2A組和BLM組的表達比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；抗體干預組各時間點IL-1β表達量與BLM組比較下降（P＜0.05）。③各組IL-1β的含量的變化趨勢無差異（F=0.990，P=0.445）。見表5。

表1 各組小鼠BALF中細胞總數比較（n =6，×106個 /ml，±s）

表1 各組小鼠BALF中細胞總數比較（n =6，×106個 /ml，±s）

組別 ____第7天 ___第14天 ___第28天NC 組 5.48±0.39 6.41±0.42 5.80±0.54 BLM 組 65.27±4.42 81.17±4.53 36.85±4.40 IgG2A組 60.43±3.21 75.92±5.38 35.94±3.52抗體干預組 __40.32±3.59 __53.38±4.07 __22.57±3.41

表2 各組小鼠BALF中中性粒細胞計數比較（n =6，×106個 /ml，±s）

表2 各組小鼠BALF中中性粒細胞計數比較（n =6，×106個 /ml，±s）

組別 ____第7天 ___第14天 第28天NC 組 2.45±0.39 2.67±0.41 2.62±0.31 BLM 組 29.05±2.84 41.00±2.15 18.45±1.45 IgG2A 組 26.65±2.04 39.32±1.50 16.94±1.36抗體干預組_____20.83±1.55____30.23±1.94_______8.5_________1±0.95

表3 各組小鼠BALF中淋巴細胞計數比較（n =6，×106個 /ml，±s）

表3 各組小鼠BALF中淋巴細胞計數比較（n =6，×106個 /ml，±s）

組別 第7天 第14天 第28天NC 組 0.51±0.07 0.79±0.12 0.80±0.07 BLM 組 5.96±0.19 6.75±0.82 5.22±0.74 IgG2A 組 5.08±0.43 6.86±0.53 5.78±0.41抗體干預組 4.03±0.21 5.23±0.20 2.26±0.45

表4 各組小鼠BALF中單核細胞計數比較（n =6，×106個 /ml，±s）

表4 各組小鼠BALF中單核細胞計數比較（n =6，×106個 /ml，±s）

組別 第7天 第14天 第28天NC 組 2.55±0.40 2.73±0.51 2.32±0.29 BLM 組 26.68±4.33 30.45±2.79 13.05±1.74 IgG2A組 23.00±3.23 28.38±2.84 10.45±1.48抗體干預組 15.95±2.68 21.42±2.19 10.09±1.08

表5 各組小鼠BALF中IL-1β的含量比較（n =6，pg/ml，±s）

表5 各組小鼠BALF中IL-1β的含量比較（n =6，pg/ml，±s）

組別 第7天 第14天 第28天NC 組 2.24±0.95 1.63±0.50 2.21±0.86 BLM 組 8.35±1.25 7.78±1.59 6.71±2.41 IgG2A 組 8.03±1.13 7.43±1.52 6.89±1.91抗體干預組 4.54±0.10 3.82±1.45 2.51±1.01

各組小鼠BALF中IL-10的含量比較，采用重復測量設計的方差分析，結果：①各組不同時間的IL-10的含量有差異（F=71.313，P=0.000）。②各組間IL-10的含量有差異（F=814.548，P=0.000）。NC組BALF中有少量IL-10的表達，而抗體干預組、IgG2A組和BLM組各時間段表達量增高，與NC組比較差異有統計學意義（P＜0.05），IgG2A組和BLM組的表達比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；抗體干預組、IgG2A組和BLM組表達高峰均在第14天，而抗體干預組表達量低于BLM組（P＜0.05）。③各組IL-10含量的變化趨勢有差異（F=17.858，P=0.000）。見表6。

表6 各組小鼠BALF中IL-10的含量比較（n =6，pg/ml，±s）

表6 各組小鼠BALF中IL-10的含量比較（n =6，pg/ml，±s）

組別 第7天 第14天 第28天NC 組 13.14±2.61 12.89±3.05 13.11±3.25 BLM 組 52.06±3.21 65.36±3.01 43.41±4.59 IgG2A 組 50.95±2.92 54.01±3.06 42.53±3.24抗體干預組 23.98±3.38 30.45±3.68 19.67±3.08

各組小鼠BALF中IL-17A的含量比較，采用重復測量設計的方差分析，結果：①各組不同時間點IL-17A的含量有差異（F=201.904，P=0.000）。②各組間IL-17A的含量有差異（F=1 126.394，P=0.000）；IL-17A在NC組各時間點BALF中有少量表達；抗體干預組、IgG2A組和BLM組各時間點表達量高于NC組，IgG2A組和BLM組的表達比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；抗體干預組、IgG2A組和BLM組第7天時均達最高峰，隨時間增加IL-17A含量逐漸減少，但于第28天仍高于NC組（P＜0.05），其中抗體干預組表達量低于BLM組（P＜0.05）。③各組IL-17A的含量變化趨勢有差異（F=38.894，P=0.000）。見表7。

表7 各組小鼠BALF中IL-17A的含量比較（n =6，pg/ml，±s）

表7 各組小鼠BALF中IL-17A的含量比較（n =6，pg/ml，±s）

組別 第7天 第14天 第28天NC 組 0.07±0.01 0.09±0.01 0.11±0.01 BLM 組 1.05±0.06 0.82±0.07 0.69±0.01 IgG2A 組 0.97±0.05 0.85±0.03 0.64±0.02抗體干預組 0.35±0.07 0.29±0.05 0.20±0.08

各組小鼠BALF中IFN-γ的含量比較，采用重復測量設計的方差分析，結果：①各組不同時間點IFN-γ的含量有差異（F=399.298，P=0.000）。②各組間IFN-γ的含量有差異（F=55.787，P=0.000）；抗體干預組、IgG2A組和BLM組BALF中IFN-γ濃度各時間點表達量較NC組增高，差異有統計學意義（P＜0.05）；IgG2A組和BLM組的表達比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。抗體干預組、IgG2A組和BLM組表達高峰均在第7天，而抗體干預組表達量低于BLM組（P＜0.05）。③各組IFN-γ含量隨時間的變化趨勢有差異（F=19.791，P=0.000）。見表 8。

表8 各組小鼠BALF中IFN-γ的含量比較（n =6，pg/ml，±s）

表8 各組小鼠BALF中IFN-γ的含量比較（n =6，pg/ml，±s）

組別 第7天 第14天 第28天NC 組 22.76±4.59 20.65±3.51 19.92±2.55 BLM 組 49.88±4.51 46.01±5.05 29.35±3.04 IgG2A 組 49.21±4.31 43.43±5.22 33.83±2.95抗體干預組 40.63±4.58 34.58±4.51 22.28±2.06

2.4 各組小鼠HYP、MDA及ROS的含量比較

各組小鼠HYP、MDA及ROS比較，采用重復測量設計的方差分析，結果：①各組不同時間點HYP、MDA及ROS的含量有差異（F=916.819、398.672和287.788，均P=0.000）。②各組間HYP、MDA及ROS的含量有差異（F=381.450、501.796和370.548，均P=0.000）；抗體干預組、IgG2A組和BLM組中HYP、MDA及ROS的含量在各個時間點與NC組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。在各個時間點，BLM組與IgG2A組比較，HYP、MDA以及ROS的含量比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；而抗體干預組與BLM組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。③各組HYP、MDA及ROS含量的變化趨勢有差異（F=70.307、19.745和39.747，均P=0.000）。見表 9～11。

表9 各組小鼠HYP的含量比較（n =10，μg/mg，±s）

表9 各組小鼠HYP的含量比較（n =10，μg/mg，±s）

組別 第7天 第14天 第28天NC 組 0.40±0.01 0.40±0.02 0.40±0.01 BLM 組 0.50±0.02 0.69±0.03 0.90±0.01 IgG2A組 0.49±0.01 0.65±0.04 0.88±0.03抗體干預組 0.45±0.02 0.56±0.04 0.76±0.04

表10 各組小鼠MDA的含量比較（n =10，nmol/mg，±s）

表10 各組小鼠MDA的含量比較（n =10，nmol/mg，±s）

組別 第7天 第14天 第28天NC 組 2.18±0.17 2.33±0.15 2.23±0.14 BLM 組 8.21±0.25 6.94±0.74 5.57±0.54 IgG2A 組 8.15±0.26 6.67±0.21 5.27±0.24抗體干預組 6.55±0.21 5.44±0.24 4.35±0.19

表11 各組小鼠ROS的含量比較（n =6，u/mg，±s）

表11 各組小鼠ROS的含量比較（n =6，u/mg，±s）

組別 第7天 第14天 第28天NC 組 90.44±3.24 87.38±2.25 90.93±3.90 BLM 組 160.95±3.95 136.35±7.02 116.04±4.37 IgG2A 組 154.39±5.01 131.43±6.34 112.50±2.76抗體干預組 132.85±5.86 116.82±6.35 101.71±3.11

2.5 各組小鼠肺組織病理學評價

NC組小鼠肺組織的Masson染色顯示肺組織輪廓清晰，纖維化未發生，肺間質未見膠原沉積；IgG2A組和BLM組肺組織纖維化明顯，并且可見大量膠原沉積；抗體干預組的肺組織纖維化程度輕于IgG2A組和BLM組。見附圖。

附圖 各組小鼠肺組織的病理切片 （Masson×100）

3 討論

肺纖維化的發生和發展進程主要包括肺組織的持續性炎癥損傷、正常的組織結構被破壞以及大量成纖維細胞灶形成，最終導致肺損傷部位的多次反復組織修復，即肺損傷和肺纖維化2個階段。炎癥細胞是肺纖維化發生發展的重要參與者。肺纖維化早期表現為肺泡炎，即肺泡上皮細胞首先被損傷，肺泡內出現出血水腫，大量炎癥細胞浸潤，該炎癥細胞會釋放出毒性物質或細胞因子等，引起肺組織損傷和結構破壞。本實驗在給予BLM后的小鼠表現為炎癥反應，BALF中細胞總數增加，早期為急性中性粒細胞浸潤，隨后過渡為淋巴細胞增多的慢性表現，與IBICKI等[7]的研究結果一致，同時單核細胞的數目也在第14天達到高峰。而注射IL-17A中和抗體后的小鼠BALF中細胞總數、淋巴細胞、單核細胞、中性粒細胞的個數均有下降，說明IL-17A中和抗體可使炎癥反應減弱。由此推斷如果在肺纖維化早期控制炎癥反應，勢必會減輕非纖維化的程度。

在肺纖維化的發生和發展過程中，由病變部位的多種細胞合成并分泌的許多細胞因子，它們之間相互影響、相互作用，就形成復雜的細胞因子網絡。肺纖維化發病機制的研究中細胞因子和細胞因子網絡的研究受到越來越多的關注。細胞因子及細胞因子復雜網絡不但在肺泡早期炎癥階段發揮重要的作用，在隨后組織修復及纖維化的過程中也發揮著極其重要的作用。

IL-1β主要由活化的單核巨噬細胞產生，是機體前炎癥免疫反應的主要誘導劑。本研究發現，IL-1β在大鼠肺纖維化發生的早期表達增加，并于肺泡炎癥階段達到峰值，而隨著肺纖維化的進一步發展又下降，并達到正常水平，提示IL-1β主要在肺纖維化發生的早期起作用，可能在肺纖維化的發生中起誘導反應的作用。

IL-10是已知的免疫和炎癥抑制因子，主要由淋巴細胞、巨噬細胞和肥大細胞等產生。實驗中發現在病變早期BALF中其表達水平即增高，第14天后處于高表達狀態，且長時間保持，說明IL-10在肺纖維化形成各階段同樣發揮重要作用。

WILSON等[8]通過不同的肺纖維化模型證實在肺纖維化發生、發展的進程中，IL-17A的表達會升高，與其相關的細胞信號通路也會在肺纖維化組織中被激活而引起一系列的效應。同時有研究表明在缺乏IL-17A作用的受體的過敏性肺炎小鼠的模型中，肺部炎癥和肺纖維化的癥狀會減輕[9]，進而證明IL-17A在肺纖維化的形成的進程中具有非常重要作用。在本研究中，抗體干預組、IgG2A組和BLM組的IL-17含量在復制模型后第7天時均達最高峰，之后IL-17A含量逐漸減少，但于第28天仍高于NC組。

IFN-γ主要由活化的T細胞和NK細胞產生，在炎癥反應中發揮重要作用，具有抗纖維化作用，可以減緩肺纖維化的進程。SEGEL等[10]研究表明，氣管內注射BLM的小鼠，其肺部產生的IFN-γ在早期炎癥反應階段增多，其持續表達對減輕纖維化程度很重要。本研究發現，抗體干預組、IgG2A組和BLM組IFN-γ含量高峰均在第7天，隨后逐步降低，各個時間點IFN-γ含量與NC組比較無差異。

ROS是有氧代謝生成的，化學性質比較活潑的一類含氧物質，主要包括氧自由基及其活性衍生物。氧自由基與其他物質發生反應，可繼發產生具有活潑生物活性的衍生物，如過氧化氫（H2O2）、脂質過氧化物等。早在1987年CANTIN等[11]的研究中檢測到肺纖維化患者的BALF中H2O2和O2-等氧化物異常升高，證明氧化應激與肺纖維化的發生是密切相關的。之后各國的科學家們開展大量的相關性研究，為闡明肺纖維發生的機制以及尋求有效的治療方案提供了一條新的途徑。有研究發現[12]，在BLM誘導的肺纖維化小鼠的模型中，發現有大量的ROS的釋放，并且其抗氧化體系也隨之發生改變，同時，若應用抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸治療BLM誘導的肺纖維化小鼠，可有效減輕肺纖維化的程度。有研究發現[13]，將小鼠的p47 phox基因敲除，因不能生成ROS，所以在BLM作用后并未發生明顯的肺纖維化。因此證明ROS參與肺纖維化的發生、發展的過程。MDA是氧自由基攻擊生物膜的不飽和脂肪酸而引發脂質發生過氧化反應的產物之一，因此測定MDA的含量可以反映體內脂質過氧化程度，并且能間接反映機體細胞受損傷程度[14]。本研究中，在復制模型后的第7、14及28天，抗體干預組小鼠肺組織ROS、MDA的含量與BLM組比較有差異。由此，推斷IL-17A中和抗體有利于減輕BLM誘導的小鼠肺纖維化氧化應激反應，從而在一定程度上減輕了肺纖維化的程度。

HYP是機體膠原蛋白的主要組成成分，占到其氨基酸總量的13%左右。僅1%左右的HYP存在于彈性蛋白中，其余的幾乎均存在于膠原中。而膠原是機體器官發生纖維化的時候，細胞外基質的重要組成成分。因此測定肺組織中的HYP的含量可以了解膠原組織的分解代謝情況，進而反映機體組織器官的纖維化程度。本研究中，抗體干預組小鼠肺組織HYP含量在各個時間點與BLM組相比有差異，進一步說明IL-17A中和抗體有利于減輕肺纖維化程度。

綜上所述，中和IL-17A在BLM誘導的肺纖維化小鼠，能減弱肺組織的炎癥反應，降低某些重要細胞因子的表達，減弱氧化應激反應，從而有效減輕肺纖維化的程度，改善小鼠的肺功能。為闡明肺纖維化的發病機制以及為臨床上研制逆轉肺纖維化的藥物提供了新的方向。