不同培養方法對小鼠脂肪干細胞成骨分化的影響*

郝宇卉，李美寧，張凱麗，楊麗紅，劉志貞

(1.忻州職業技術學院 醫學系，山西 忻州 034000；2.山西醫科大學生物化學與分子生物學教研室，山西 太原 030001)

由于骨組織再生能力極其有限，骨損傷修復成為目前臨床醫學、藥學等領域研究的熱點與難點。骨組織工程學是在探索骨損傷修復治療模式基礎上發展起來的一門新興學科，其包括三大要素，即種子細胞、支架及誘導因子，其中種子細胞是骨損傷修復治療的基礎[1-2]。間充質干細胞（mesenchymal stem cells,MSCs）因其組織來源豐富，免疫原性低，具有較強的增殖與分化潛能和免疫調節作用，逐漸成為較為理想的種子細胞，在骨損傷修復領域取得較大研究進展[3-4]。脂肪干細胞是來源于脂肪組織的MSCs，相對于其他組織來源的MSCs，脂肪干細胞取材更為方便，創傷小，可極大降低實驗成本。此外，脂肪組織中脂肪干細胞含量豐富，具有極強的增殖分化能力，可分化為成骨細胞，較易體外培養，適合作為骨組織工程學的種子細胞[5-7]。研究發現，脂肪干細胞在治療骨缺損和骨折中具有顯著效果[8-9]。原代脂肪干細胞體外培養方法有多種，常用的方法包括膠原酶消化法和組織塊貼壁法[10]，不同培養方法對脂肪干細胞成骨分化是否有影響，目前尚無定論。本實驗分別采用膠原酶消化法和組織塊貼壁法對小鼠脂肪干細胞進行體外培養，對兩種方法所得細胞進行鑒定并對其增殖能力、成骨分化能力進行比較，以期尋找更適合體外培養脂肪干細胞的方法，為骨組織損傷修復研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑與儀器

無特定病原體（SPF）級6～8周齡雌性BALB/c小鼠8只，體重20～25 g，購自山西醫科大學實驗動物中心。L-DMEM培養基（美國Gibco公司）、10%胎牛血清（美國Gibco公司）、青鏈霉素混合液（北京索萊寶科技有限公司）、EDTA（美國Gibco公司）、TRYPSIN 1∶250（北京索萊寶科技有限公司），成脂誘導培養基組合、成骨誘導培養基組合（廣州賽業生物科技有限公司），Anti-Ly-6A/E（Sca-1）PE、Anti-CD44 PE、Anti-CD31 （PECAM）FITC（美國eBioscience公司），磷酸鹽緩沖溶液（PBS）粉劑（北京索萊寶科技有限公司），I型膠原酶、油紅O染液、茜素紅染液（美國Sigma公司），堿性磷酸酶試劑盒-ALP（金氏法）（北京北化康泰臨床試劑有限公司），鈣含量比色檢測分析試劑盒（美國Bio Vision公司），其余試劑如多聚甲醛、CCK-8試劑盒、二甲基亞砜、生理鹽水均購自上海生工生物工程股份有限公司，為國產分析純。

低溫冰箱（合肥中科美菱低溫科技有限責任公司），恒溫水浴箱（上海應用恒溫設備廠），電子天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司），超純水制備儀（美國Millipore公司），外科手術器械（上海醫療器械廠），移液器（北京吉爾森科技有限公司），超凈工作臺（安徽航天生物科技），流式細胞儀（美國Beckman Coulter公司），細胞培養箱（美國Thermo公司），普通光學顯微鏡（德國Leica公司），其他耗材如EP管、離心管、細胞培養皿、培養瓶等均購自美國Corning公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 小鼠脂肪干細胞的分離與培養 脫頸處死實驗小鼠，常規脫毛備皮，固定于實驗臺上，消毒皮膚，沿腹股溝、腹白線剪開皮膚，暴露皮下組織，仔細剝離腹部、腹股溝皮下脂肪組織，收集于盛PBS液（含雙抗）的培養皿中，皿置于冰上。

組織塊貼壁法：將分離的脂肪組織用手術剪剪碎成1 mm×1 mm×1 mm，用含雙抗的PBS沖洗組織塊3次，將組織塊按一定間距轉入L-DMEM培養基預處理過的T25細胞培養瓶，靜置30～40 min，加入少量L-DMEM培養基（含10%胎牛血清，1%青鏈霉素），置于37℃ 5%二氧化碳CO2恒溫培養箱內培養，觀察細胞貼壁情況，定期更換培養液，待細胞融合達90%后進行傳代。

膠原酶消化法：將收集的脂肪組織剪碎成1 mm×1 mm×1 mm，加入適量0.075% I型膠原酶，37℃恒溫水浴50 min，等體積L-DMEM培養基終止消化，離心（1 000 r/min，5 min），棄上清液，L-DMEM培養基（含10%胎牛血清，1%青鏈霉素）重懸，過濾，等量接種于T25細胞培養瓶，置于37℃ 5% CO2的恒溫培養箱內培養，觀察細胞生長情況，定期換液，待細胞融合達90%后，進行傳代培養。

1.2.2 脂肪干細胞形態觀察 稱取同等重量的脂肪組織，分別用上述兩種方法培養，選擇第3代生長狀態較好的細胞，顯微鏡下觀察細胞形態并計數。脂肪干細胞形態類似成纖維細胞，呈長梭形，胞漿豐富，核偏大，貼壁生長，呈旋渦狀。

1.2.3 脂肪干細胞生長曲線分析 分別取上述兩種培養方法所得生長狀態良好的第3代脂肪干細胞，胰酶消化后制備成單細胞懸液，細胞計數儀計數，調整細胞濃度均以1×104個/孔接種到24孔板，對照組不接種細胞加入等量細胞培養液。采用CCK-8法檢測細胞增殖情況，按說明書進行操作，連續7 d，每天檢測1個24孔板，酶標儀檢測光密度（OD）值，繪制這兩種不同培養方法所得細胞的生長曲線。

1.2.4 脂肪干細胞表面標志物檢測 分別取上述兩種培養方法下生長狀態良好的第3代細胞進行細胞表面標志物Sca-1、CD44、CD31檢測。將細胞用胰酶消化后制備成單細胞懸液，細胞計數儀計數，調整細胞濃度為3×107個/ml，各取50 μl細胞懸液到流式管中，分別加入50 μl稀釋好的待檢抗體，4℃避光孵育1 h，每管加入緩沖液2 ml，離心（1 000 r/min，5 min），棄上清，PBS沖洗，0.2 ml緩沖液重懸細胞后采用流式細胞儀進行分析檢測。

1.2.5 脂肪干細胞成脂誘導分化能力檢測 分別選取上述兩種培養方法所得第3代細胞，胰酶消化后制備成細胞懸液，兩組分設陰性對照組，繼續用L-DMEM培養；兩種培養方法的誘導組以2×105個/cm3密度分別接種于2個6孔板，每孔加等量L-DMED培養基，觀察細胞生長情況，待細胞長滿時換等量成脂分化誘導培養基A液，培養3 d換成脂分化誘導培養基B液，培養24 h后再換為等量A液，如此循環，10 d后顯微鏡下觀察脂滴形成情況，再換為B液培養3 d，去培養基，PBS清洗細胞，4%多聚甲醛固定，PBS清洗，油紅O染色40 min，PBS洗去染液，顯微鏡下觀察。

1.2.6 脂肪干細胞成骨誘導分化能力檢測 分別取上述兩種培養方法所得生長狀態良好的第3代細胞，胰酶消化后制備成細胞懸液，以3×105個/cm3密度接種于明膠預處理過的6孔板，陰性對照組加入L-DMEM培養，誘導組加入成骨誘導液2 ml，每3天換液1次，誘導培養15 d后，棄培養基，PBS洗滌2次，4%多聚甲醛固定，室溫放置30 min，PBS洗滌2次，茜素紅染液染色20 min，PBS洗滌。顯微鏡下觀察細胞成骨分化情況，分別選取5個不同視野拍照，用于圖像分析，采集礦化結節面積、視野面積。應用公式（礦化結節面積/視野面積×100%）計算礦化面積百分比。

1.2.7 堿性磷酸酶（ALP）活性檢測 分別取成骨誘導培養15 d的兩組細胞，棄培養液，PBS洗滌細胞，超聲細胞破碎儀裂解細胞，離心（3 000 r/min，10 min），取上清液，按照ALP說明書操作，首先繪制標準曲線，每組樣本均稀釋10倍，分5份在520 nm波長下測定OD值，通過標準曲線獲得每一份樣本濃度并乘以稀釋倍數，計算出各組ALP活性濃度。

1.2.8 鈣離子濃度檢測 分別取成骨誘導培養15 d的兩組細胞，培養液中加入0.5 mol/L HCl常溫下過夜，使細胞中鈣鹽分解為鈣離子。兩組樣本各分5份，按鈣含量比色檢測分析試劑盒說明書要求進行操作。首先通過標準曲線OD值獲得鈣含量值（μg/well），再通過公式C=Sa/Sv（mg/dl）計算出鈣離子濃度。

1.3 統計學方法

數據分析采用SPSS 22.0統計軟件、Image Pro Plus 6.0軟件和Prism 5作圖軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較采用t檢驗或重復測量設計的方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 脂肪干細胞形態比較

組織塊貼壁法培養脂肪干細胞，第3天時，組織塊邊緣開始出現少量細胞，貼壁生長，呈短梭形、多角形或者圓形（見圖1A）；培養第10天，細胞生長迅速，融合達80%。膠原酶消化法培養脂肪干細胞，第20小時，細胞開始逐漸貼壁生長，第3天，細胞生長增快，呈短梭形、三角形（見圖1B），培養第7天，細胞融合達80%左右。兩種方法所得脂肪干細胞，傳代后生長迅速，傳至第3代，可見細胞形態均一，均呈長梭形，漩渦樣生長（見圖1C、1D）。培養至第10代，細胞均開始老化，形態出現變化。

圖1 脂肪干細胞生長情況

2.2 脂肪干細胞生長曲線比較

兩種方法所得的脂肪干細胞在第4、5、6和7天的增殖情況進行比較，采用重復測量設計的方差分析，結果：①各時間點的增殖情況有差異（F=0.562，P=0.000）。②兩種培養方法所得細胞的增殖情況有差異（F=0.221，P=0.000），從第4天開始，組織塊貼壁法培養所得細胞的增殖情況高于膠原酶消化法。③兩種培養方法所得細胞增殖的變化趨勢有差異（F=0.613，P=0.000）。從生長曲線可以看出，細胞生長具有滯留期、對數生長期和平臺期。見附表和圖2。

附表 兩種方法所得脂肪干細胞各時間點的增殖狀況比較 （n =5，±s）

附表 兩種方法所得脂肪干細胞各時間點的增殖狀況比較 （n =5，±s）

方法 第4天 第5天 第6天 第7天組織塊貼壁法 0.51±0.49 0.72±0.67 0.80±0.74 0.82±0.67膠原酶消化法 0.39±0.37 0.56±0.56 0.60±0.54 0.61±0.59

圖2 兩種方法所得脂肪干細胞生長曲線 （±s）

2.3 脂肪干細胞表面標志物檢測結果

組織塊貼壁法所得脂肪干細胞CD44表達率為98.57%，Sca-1表達率為95.16%，CD31表達率為7.09%。膠原酶消化法所得脂肪干細胞CD44表達率為95.83%，Sca-1表達率為92.72%，CD31表達率為7.04%。見圖3。

圖3 兩種方法所得脂肪干細胞表面標志物檢測結果

2.4 脂肪干細胞成脂誘導結果

從第5天開始可見脂滴形成，第7～9天，脂滴形成量增多，呈融合趨勢，油紅O染色呈陽性，陰性對照組染色為陰性，證實所培養細胞為脂肪干細胞。見圖4。

2.5 脂肪干細胞成骨誘導結果

誘導15 d后，陰性對照組茜素紅染色陰性，誘導組可見礦化結節形成，茜素紅染色后證實為礦化結節。組織塊貼壁法培養所得脂肪干細胞礦化面積百分率[（30.10±2.03）%]高于膠原酶消化法[（12.03±1.22）%]，差異有統計學意義（t=17.071，P=0.000）。見圖5。

圖4 兩種方法所得脂肪干細胞成脂分化結果 （×100）

圖5 兩種方法所得脂肪干細胞成骨分化結果

2.6 脂肪干細胞ALP活性檢測結果

成骨誘導培養第14天后，兩種培養方法所得脂肪干細胞ALP活性比較，差異有統計學意義（t=4.338，P=0.002），與膠原酶消化法比較，組織塊貼壁法所得脂肪干細胞ALP活性更高，見圖6A。

2.7 脂肪干細胞鈣離子濃度檢測結果

成骨誘導培養第14天后，兩種培養方法所得脂肪干細胞培養液中鈣離子濃度比較，差異有統計學意義（t=9.430，P=0.000），與膠原酶消化法比較，組織塊貼壁法所得細胞培養液中鈣離子濃度活性更高。見圖6B。

圖6 兩種方法所得脂肪干細胞成骨分化能力檢測結果（±s）

3 討論

脂肪干細胞作為骨損傷修復的種子細胞，在細胞治療領域有很大潛能[11-19]。但關于不同培養方法對其成骨分化能力的影響，目前鮮有報道。骨損傷定義為由于各種因素包括感染、外傷、腫瘤等引起的骨質破壞與缺損[20]。由于骨的再生能力極其有限，骨損傷修復成為骨科醫學、再生醫學等研究的熱點與難點[21-22]。近年來，骨組織工程的興起為骨損傷修復研究帶來曙光，種子細胞作為骨組織工程學研究的重要基礎，受到眾研究學者的青睞[23]。脂肪干細胞因其取材方便，創傷小，實驗成本低，體外較易培養及強大的增殖分化能力，包括成骨分化能力，逐漸成為骨組織工程較理想的種子細胞[24-25]。實驗研究發現，脂肪干細胞可通過歸巢機制修復骨質疏松小鼠骨損傷，并可修復不同病理狀態下的軟骨損傷，定向分化為成軟骨細胞，促進骨損傷修復[8-9，26]。

原代脂肪干細胞的培養主要包括組織塊貼壁法和酶消化法，本研究結果發現兩種培養方法所得細胞形態一致，生物學特性穩定，均高表達CD44、Sca-1，弱表達CD31，在誘導劑作用下，可定向分化為成脂細胞、成骨細胞，因此證實所培養細胞為脂肪干細胞。并且組織塊貼壁法培養所得脂肪干細胞比膠原酶消化法細胞增殖更快，表明前者具有更強的增殖能力。

脂肪干細胞成骨分化的過程大致分為2個階段，首先，脂肪干細胞分化為成骨細胞，其次，成骨細胞進行增殖并分泌骨基質，骨基質鈣化成骨，全程大約需要2～3周。ALP是成骨細胞早期分化的標志酶，其促進成骨細胞鈣和磷的沉積。通常認為，ALP是成骨細胞外基質成熟的早期標志物，因而研究中常用該酶的活性體現成骨細胞的存在和分化程度[27]。成骨細胞是促進骨礦化的主要細胞，可分泌ALP和鈣鹽結晶體至細胞外基質，促使基質礦化，而礦化則是細胞進一步分化成熟的表現。因此檢測細胞外基質中ALP活性及鈣離子濃度可間接反應脂肪干細胞成骨分化能力。脂肪干細胞成骨分化過程受多種因素影響，包括供體因素、實驗因素、生長因子、理化因素等[28]。在本研究中，組織塊貼壁法培養所得脂肪干細胞成骨誘導分化15 d后，所形成礦化面積百分比高于膠原酶消化法，其次，ALP活性在組織塊法所得脂肪干細胞成骨誘導分化15 d后活性高于膠原酶消化法，細胞外基質中鈣離子濃度亦然。以上結果均表明，組織塊貼壁法相對膠原酶消化法在脂肪干細胞培養及成骨誘導分化過程中更具優勢。

膠原酶消化法的優點是接種細胞數可定量，培養細胞純度高；但其缺點是取材量大、酶對細胞的損傷不好控制、操作步驟多，影響因素多，耗時長。組織塊貼壁法缺點是分離純度不是很理想，接種細胞數不能定量；但其優點是經濟，取材量較酶消化法少，操作簡單，影響因素少，可避免酶對組織細胞的損害。結合本次實驗結果，本研究認為組織塊貼壁法更適合體外脂肪干細胞成骨誘導分化研究。