GH/IGF1軸對非酒精性脂肪肝病脂代謝的影響及可能機制研究*

鄒琳，李鐵巖，錢麗娟，童學科，費悅 ，徐霞紅，佘會元

（1.寧夏醫科大學，寧夏 銀川 750004；2.同濟大學附屬東方醫院 心臟外科，上海 200120；3.上海市浦東新區公利醫院 感染科，上海 200135）

非酒精性脂肪肝病（nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD）是目前全球最常見的慢性肝病，發病率高達25%～40%，在我國城市人口中的患病率高達27%，兒童發病率為2.1%，若合并肥胖，發病率上升至68.2%[1-2]。預計到2030年NAFLD將成為肝移植的最主要原因[3-4]。脂質代謝異常以及胰島素抵抗被普遍公認為NAFLD進展的第一重打擊，同時激素代謝紊亂也與NAFLD發病密切相關[5-7]。生長激素/胰島素樣生長因子1（GH/IGF1）軸也被稱為生長軸，由垂體釋放的GH與肝細胞膜上的生長激素受體（GHR）相結合并通過“JAK2-STAT5b”通路促進肝細胞合成并釋放IGF1，共同參與調節機體的生長、發育、代謝，以及各類激素的平衡。越來越多的研究發現[8-10]NAFLD患者，包括兒童血清中的GH水平升高、IGF1和胰島素樣生長因子結合蛋白3（IGFBP3）水平下降，并且IGF1、IGFBP3下降程度與NAFLD脂肪變性程度呈正相關，提示GH/IGF1軸可能參與NAFLD發病過程，GH、IGF1參與NAFLD的脂質調節[11]，但具體的調節機制仍不清楚。本實驗通過復制NAFLD細胞模型，觀察不同劑量的GH、IGF1干預下的肝內三酰甘油（TAG）合成和脂肪酸合成酶（FASN）、固醇調節元件結合蛋白（SREBP-1C）、過氧化物酶體增殖劑激活受體γ（PPAR-γ）的變化，進一步探討GH/IGF1軸在NAFLD中對脂代謝的影響及可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

人正常肝細胞HL-7702（L02）細胞株購自中國科學院上海細胞生物學研究所，FBS（10270-106）購自美國Gibco公司，DMEM培養基（SH30021.01B）、雙抗（SV30010）、磷酸鹽緩沖溶液（PBS）（SH30256.01B）購自美國Hyclone公司，0.25%胰酶（150050-065）、Random Primer購自美國 Invitrogen 公司，DMSO（D2650）、BSA（B2064）、油酸（O1383）、棕櫚酸（P5585）、油紅O（O0625）染色購自美國Sigma公司，BCA法蛋白檢測試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司，TAG測 試 盒、Trizol（B610409-0100）、DEPC原 液（B548110-0200）購自南京建成生物工程研究所，人重組IGF-I（100-11）、人重組GH（100-40）購自美國 peprotech 公司，IGF1（E04580h）、IGFBP3（E04590h）試劑盒購自美國CUSABIO公司，三氯甲烷（氯仿）（分析純AR，500 ml）、無水乙醇分析純AR（500 ml）購自上海國藥集團化學試劑有限公司，異丙醇分析純AR（500 ml）購自上海展云化工有限公司，dNTPs購自上海兆維科技發展有限公司，M-MLV M170B、Oligo dT（50 μmol）購自美國Promega公司，RNasin（2313A）、SYBR Green I qPCR mix購自日本TaKaRa公司，引物購自上海捷瑞生物合成公司。

1.2 儀器與設備

二氧化碳CO2培養箱（美國Thermo公司），倒置顯微鏡（日本Nikon公司），7500 real-time PCR儀（美國Applied Biosystems公司），酶標儀（美國Molecular Devices公司）。

1.3 方法

1.3.1 細胞解凍、傳代 液氮中取出凍存L02細胞，37℃水浴中解凍，冷凍細胞剛解凍為液體時迅速取出，在生物安全柜中轉移到15 ml離心管中，加入5 ml培養基，1 000 r/min離心5 min，吸去上清液，細胞沉淀重懸5 ml培養基中，轉移到T25培養瓶中，上下左右混勻，放入5% CO2培養箱中培養。取對數生長期的細胞，當細胞生長至70%～80%融合度時，進行傳代。吸去培養基，PBS清洗2次，加入0.25%胰酶溶液，孵育1～5 min，顯微鏡下觀測消化進程，觀察到細胞變圓，輕拍培養瓶有少量細胞漂起即可加入含血清培養基終止消化，重懸消化細胞，轉移到15 ml離心管中，1 000 r/min離心5 min收集細胞，按1∶3或1∶4比例接種到新培養瓶中培養。

1.3.2 NAFLD細胞模型復制 將油酸和軟脂酸按2∶1比例配成20 nmol FFA母液，并加入到DMEM高糖完全培養液中，配成1 mmol的高脂完全培養基，細胞貼壁后放入高脂培養基中，繼續放置在5% CO2的37℃恒溫培養箱中繼續培養。誘導24、48及72 h后收獲細胞，稱取0.25 g油紅O干粉，溶于少量異丙醇中，然后加異丙醇至50 ml，配成油紅O染色液進行細胞染色。染色時，吸去細胞培養液，用PBS輕柔漂洗后加入10%中性甲醛固定15 min，然后用油紅O染液染色10 min，PBS漂洗后用蘇木精復染5 min，雙蒸水（ddH2O）漂洗后，顯微鏡下觀察并拍照，以細胞質內出現橘紅色的脂滴為脂質變性細胞。

1.3.3 rhGH和rhIGF1刺激NAFLD細胞及分組 為觀察GH/IGF1軸對脂代謝影響，分別選擇25 ng/ml rhGH、250 ng/ml rhGH、50 ng/ml rhIGF1、500 ng/ml rhIGF1加入正常細胞和NAFLD細胞培養中，加藥24 h后開始收集細胞并進行相關檢測。見表1。

表1 rhGH、rhIGF1干預濃度與分組

1.3.4 TAG檢測 TAG主要采用GP-PAP酶法檢測。將制備好的GH、IGF1干預后的L02細胞、NAFLD細胞以及未加藥組的細胞懸液分別取出，1 000 r/min，離心10 min，棄上清液，留細胞沉淀；用PBS清洗2次，同樣1 000 r/min，離心10 min，棄上清液，留細胞沉淀。將收集的細胞采用1%的Triton X-100進行化學裂解，分別在細胞收集樣本中加入200 μl，冰水浴條件下裂解30 min。將裂解后的細胞混合液分成2部分，一部分采用BCA法蛋白定量，一部分進行TAG檢測，將各2.5 μl的裂解細胞懸液分別加入96孔板中，并設置空白對照以及2.26 mmol/L標準品（甘油）對照；分別加入250 μl工作液，充分混勻后37℃孵育10 min，反應達到平衡后顏色在60 min內穩定。空白管調測OD值，采用酶標儀測量標準孔及待測樣品500 nm的OD值，繪制標準曲線并計算TAG濃度。

1.3.5 實時熒光定量聚合酶鏈反應（qR T-PCR）采用Trizol法提取NAFLD細胞總RNA，通過Nanodrop ND-2000鑒定提取的RNA濃度以及純度，確定后進行mRNA逆轉錄，先按RNA 1 μg，Oligo dT（50 μmol）1 μl，Rnase-Free-H2O 加至 10 μ l配置反應液一，并在70℃孵育5 min，然后迅速冰浴3 min，將反應液一，5×M-MLV buffer 4 μl，M-MLV（200 u/μl）1 μl，RNasin（40 u/μl）0.25 μl，dNTPs（2.5 mmol/L）4 μl，并Rnase-Free-H2O加至20 μl，配置后混勻，采用42℃ 60 min，70℃ 15 min反應條件進行逆轉錄，獲得的cDNA放入-20℃冰箱冷凍保存。將cDNA稀釋10倍，通過Primer 5.0軟件設計引物序列（見表2），β-actin作為內參設置對照，qRT-PCR反應體系：樣本 cDNA 2 μl，10 μmol正向引物 0.4 μl，10 μmol反向引物 0.4 μl，SYBR Green I qRT-PCR mix 10 μl，ddH2O加至20 μl反應體系，反應程序：95℃預變性5 min，95℃變性10 s，60℃退火20 s，72℃延伸20 s，共40個循環，熔解曲線。采用2-ΔΔCt法計算基因相對表達量。

表2 PCR引物列表

1.3.6 細胞上清液中IGF1、IGFBP3含量檢測 采用酶聯免疫吸附測定（ELISA）檢測上清液IGF1、IGFBP3含量，將制備好的L02細胞和NAFLD細胞懸液，1 000 r/min離心10 min，棄細胞，留取上清液待測；進行標準品的制備，使標準品稀釋濃度分別為500.0、250.0、125.0、62.5、31.2、15.6、7.8 和 0.0 ng/ml，在 96孔板的酶標板孔中分別加入空白對照，標準品以及樣品100 μl，37℃溫浴2 h后，分別加入100 μl酶Biotin抗體，37℃溫浴1 h并洗滌5次，依次加入100 μl的顯色劑HRP，37℃溫浴1 h并洗滌5次和90 μl的顯色劑TMB，避光，37℃溫浴30 min后加入50 μl終止液，450 nm波長進行測量。

1.4 統計學方法

數據分析采用Graphpad Prism 5.0統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，符合正態分布采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗，多時間點比較采用重復測量設計的方差分析，非正態分布采用Wilcoxon、Mann-WhitneyU檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NAFLD細胞模型制備

1 nmol FFA高脂培養基培養L02細胞24、48和72 h后，通過倒置顯微鏡可見L02組的細胞邊緣清晰可見，核大，其內可見核分裂相，核膜完整，細胞胞漿豐富，油紅O染色后，僅在細胞邊緣可見少量小的紅染脂滴。L02 NAFLD組可見細胞變圓，胞漿內及細胞周圍可見大量紅染的脂滴，細胞核大，部分被擠到一側，呈印戒樣改變。見圖1。

圖1 L02組和L02 NAFLD組細胞脂滴沉積情況（油紅O染色×400）

2.2 NAFLD細胞GH/IGF1軸功能改變

2.2.1 GHR、IGF1、IGFBP3 mRNA表達比較 L02 NAFLD組細胞中GH/IGF1軸功能抑制與L02組比較，差異有統計學意義，其中GHR mRNA表達高于L02組（P＜0.05）。IGFBP3 mRNA 表達低于 L02組（P＜0.05），IGF1 mRNA 表達差異無統計學意義（P＞0.05），L02 NAFLD組輕度減少。見表3和圖2。

2.2.2 IGF1、IGFBP3蛋白表達比較 兩組細胞上清液中IGF1、IGFBP3的蛋白表達見圖3。24 h時，兩組上清液中IGF1、IGFBP3未見明顯差異。48 h時，L02 NAFLD組與L02組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），L02 NAFLD組IGF1和IGFBP3均低于L02組（見表4）。

表3 兩組細胞CHR、IGF1、IGFBP3 mRNA表達比較（±s）

表3 兩組細胞CHR、IGF1、IGFBP3 mRNA表達比較（±s）

組別 CHR IGF1 IGFBP3 L02 組 0.539±0.095 0.385±0.086 0.867±0.112 L02 NAFLD組 0.854±0.103 0.366±0.045 0.359±0.069 t值 2.238 0.186 3.613 P值 0.040 0.855 0.002

圖2 兩組細胞GHR、IGF1、IGFBP3 mRNA表達 （±s）

圖3 兩組細胞IGF1、IGFBP3蛋白表達水平 （±s）

表4 兩組細胞48 h IGF1、IGFBP3蛋白表達比較（±s）

表4 兩組細胞48 h IGF1、IGFBP3蛋白表達比較（±s）

組別 IGF1 IGFBP3 L02組 0.385±0.086 0.359±0.069 L02 NAFLD 組 0.366±0.045 0.867±0.112 t值 23.370 4.410 P值 0.002 0.037

2.3 TAG含量比較

兩組細胞中24、48和72 h的TAG含量比較，采用重復測量設計的方差分析，結果：①不同時間點的TAG含量有差異（F=229.91，P=0.000）；②L02 NAFLD組和L02組的TAG含量有差異（F=616.96，P=0.000），L02 NAFLD細胞組TAG含量升高；③L02 NAFLD組與L02組的TAG變化趨勢有差異（F=629.920，P=0.000）。見表5和圖4。

2.4 兩組細胞FASN、SREBP-1C、PPAR-γ mRNA表達比較

L02 NAFLD組中PPAR-γ和SREBP-1C mRNA與L02組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），L02 NAFLD組中PPAR-γ mRNA表達高于L02組，SREBP-1C mRNA表達低于L02組。見表6和圖5、6。

表5 兩組細胞TAG含量比較 （mmol/L，±s）

表5 兩組細胞TAG含量比較 （mmol/L，±s）

組別 24 h 48 h 72 h L02組 0.289±0.001 0.252±0.002 0.246±0.004 L02 NAFLD 組 0.411±0.014 0.401±0.015 0.464±0.010

圖4 兩組細胞TAG含量比較 （±s）

表6 兩組細胞FASN、SREBP-1C、PPAR-γ mRNA表達比較 （±s）

表6 兩組細胞FASN、SREBP-1C、PPAR-γ mRNA表達比較 （±s）

組別 FASN SREBP-1C PPAR-γ L02 組 0.554±0.103 0.510±0.090 0.599±0.048 L02 NAFLD組 0.593±0.105 0.309±0.034 0.837±0.078 t值 0.267 2.790 2.580 P值 0.793 0.027 0.024

圖5 兩組細胞FASN、SREBP-1C mRNA表達比較 （±s）

圖6 兩組細胞PPAR-γ mRNA表達比較 （±s）

2.5 rhGH、rhIGF1干預后TAG含量變化

NAFLD細胞中，rhGH干預組：25 ng/ml（rhGH-L）、250 ng/ml（rhGH-H） 和 rhIGF1干 預 組：50 ng/ml（rhIGF1-L）、500 ng/ml（rhIGF1-H）分別干預24、48和72 h后，通過重復測量設計的方差分析檢測TAG含量，其中L02 NAFLD組為未加藥組。結果：①不同時間點的TAG含量有差異（F=172.330，P=0.000）；②不同干預組間的TAG含量有差異（F=20.460，P=0.000）；③不同干預組間的TAG變化趨勢有差異（F=49.320，P=0.000）。而在正常細胞（L02）中，結果：①不同時間點的TAG含量有差異（F=15922.060，P=0.000）；②不同干預組間的TAG含量有差異（F=3958.550，P=0.000）；③不同干預組間的TAG變化趨勢有差異（F=624.850，P=0.000）。見表 7 和圖 7。

表7 兩組細胞在不同干預條件下TAG變化（mmol/L，±s）

表7 兩組細胞在不同干預條件下TAG變化（mmol/L，±s）

組別 24 h 48 h 72 h正常細胞組未干預組 0.289±0.001 0.252±0.002 0.246±0.004 rhGH-H 組 0.473±0.004 0.273±0.001 0.342±0.003 rhGH-L 組 0.463±0.005 0.268±0.002 0.320±0.001 rhIGF1-H 組 0.356±0.002 0.215±0.001 0.258±0.024 rhIGF1-L 組 0.421±0.003 0.261±0.002 0.283±0.003 NAFLD組未干預組 0.411±0.014 0.401±0.015 0.446±0.009 rhGH-H 組 0.576±0.004 0.446±0.039 0.534±0.018 rhGH-L 組 0.517±0.004 0.441±0.027 0.427±0.002 rhIGF1-H 組 0.583±0.003 0.448±0.037 0.427±0.020 rhIGF1-L 組 0.531±0.009 0.514±0.016 0.446±0.010

圖7 兩組細胞經rhGH、rhIGF1干預后TAG含量（±s）

2.6 rhGH、rhIGF1干預后FASN、SREBP-1C、PPAR-γ mRNA表達比較

在NAFLD細胞中，與未加藥組（L02 NAFLD）比較，rhGH-H，rhGH-L，rhIGF1-L干預下的NAFLD中PPAR-γ mRNA表達差異有統計學意義（t=8.990、7.530和 4.280，P=0.002、0.006和 0.012），3組干預下的PPAR-γ mRNA低于未加藥組；rhIGF1-H干預下的NAFLD中SREBP-1C mRNA表達差異有統計學意義（t=-5.190，P=0.028），SREBP-1C mRNA表達高于未加藥組。見表8和圖8。

表8 rhGH、rhIGF1干預后FASN、SREBP-1C、PPAR-γ mRNA表達比較 （±s）

表8 rhGH、rhIGF1干預后FASN、SREBP-1C、PPAR-γ mRNA表達比較 （±s）

注：?P ＜0.05

組別 FASN SREBP-1C PPAR-γ未加藥組 0.623±0.266 0.364±0.048 0.923±0.058 rhGH-H 組 0.677±0.269 0.494±0.195 0.297±0.053?rhGH-L 組 0.684±0.189 0.353±0.089 0.388±0.027?rhIGF1-H組 0.782±0.295 0.973±0.197? 0.900±0.259 rhIGF1-L 組 0.746±0.271 0.465±0.162 0.443±0.185?

圖8 rhGH、rhIGF1干預下NAFLD中FASN、SREBP-1C、PPAR-γ mRNA 表達比較 （±s）

3 討論

NAFLD是累及肝臟及多個肝外組織的肝臟代謝綜合征，NAFLD患者多易合并糖尿病、高脂血癥、高胰島素血癥，肥胖、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（以下簡稱冠心病）等疾病，研究發現2型糖尿病患者合并脂肪肝的可能性高達80%，并且進展為NASH的風險較單純脂肪肝高2～4倍[12]，NAFLD患者發生動脈粥樣硬化和冠心病的風險明顯升高[13]，而這些疾病與機體的脂質代謝紊亂和異常沉積密切相關。脂質代謝研究一直是NAFLD研究的重點和熱點。

GH/IGF1軸在NAFLD人群表現GH抵抗，IGF1、IGFBP3水平下調，并與NAFLD的嚴重程度呈正相關[14-15]，血清低水平IGF1的肝癌患者的疾病進展時間縮短和生存時間更短，低水平IGF1與肝癌風險升高密切相關，且早于肝癌診斷至少5年[16]。

本研究結果提示，由FFA誘導L02細胞的NAFLD細胞模型中，IGF1、IGFBP3 mRNA以及蛋白水平均下調，機體出現GH抵抗，GH/IGF1軸功能被抑制，這與臨床中觀察到的GH、IGF1變化一致。NAFLD細胞中，24、48和72 h的細胞內TAG含量均較正常細胞升高，脂合成基因PPAR-γ的合成增加，PPAR-γ是脂質合成的重要調控基因，可以誘導肝內脂質堆積，促進TAG合成[17-18]，PPAR-γ及其靶點CD36可以促進游離脂肪酸的吸收，PPAR-γ的高表達可以誘導成脂性基因FASN、SREBP-1表達轉錄增加[19]。經不同濃度rhGH、rhIGF1干預后，可以看到正常細胞和NAFLD細胞在早期（24 h）細胞內TAG含量均升高，但72 h后時細胞內TAG含量明顯下降。其中NAFLD細胞中PPAR-γ mRNA表達水平下調，說明GH、IGF1可能通過下調PPAR-γ從而減少肝細胞內脂質合成。另外，NAFLD組細胞中GHR、IGF1、IGFBP3 mRNA表達低于正常細胞，且細胞中TAG含量升高不及正常細胞，說明FFA與GH/IGF1軸之間可能存在負調控，而在人體骨骼肌中也發現，隨著FFA濃度升高，骨骼肌中STAT5b磷酸化水平明顯下調[20]。

綜上所述，GH/IGF1軸在NAFLD中受抑制，GH/IGF1可能通過抑制PPAR-γ參與調控NAFLD中脂代謝，并與FFA之間存在負反饋調節。