磷酸化表皮生長因子受體表達與糖尿病皮膚病變關系的實驗研究

王力，何揚 ，趙東波，陳樹梅，袁琳 ，王曉迪

（1.珠海市人民醫院 內分泌代謝科，廣東 珠海 519000；2.杭州師范大學健康管理系，浙江 杭州 311121）

表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）在體內含量廣泛，屬于ErbB受體家族[1]，是一種位于細胞膜的跨膜受體蛋白，它與配體表皮生長因子（epidermal growth factor, EGF）結合后，啟動體內一系列信號傳遞，從而促進細胞的生長、增殖與分化，是一種受體酪氨酸激酶[2-4]。糖尿病可引發多種并發癥，皮膚病是一種常見并發癥。糖尿病患者皮膚具有易感性，皮膚組織在無外源性創傷的情況下，其細胞、生長因子、細胞外基質等就已經發生改變，這種“隱形損害”可導致糖尿病創面形成甚至長期不愈。皮膚穩態失衡和形態結構變化可導致病變，例如皮膚發黃干燥。EGFR在糖尿病患者體內許多組織中數量、性質及表達發生改變[5-6]。有研究認為[7-8]，糖尿病患者皮膚中葡萄糖含量增高，皮膚的屏障作用降低，使患者易感染皮膚病，而關于這種易感性與EGFR是否有關的報道很少。

本研究通過鏈脲佐菌素復制大鼠糖尿病模型，測定皮膚中糖和糖基化終末產物（advanced glycation end products, AGEs）的含量及磷酸化表皮生長因子受體（pEGFR）表達水平，觀察大鼠皮膚組織病理學變化，研究pEGFR表達與糖尿病皮膚病變關系，探討其機制，為糖尿病并發皮膚病的治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑

清潔級健康成年SD雄性大鼠，體重（200±20）g（山東魯抗醫藥股份有限公司實驗動物中心）。鏈脲佐菌素STZ（美國 Sigma公司），SP試劑盒（南京建成公司），pEGFR抗體、抗pEGFR抗體、抗AGEs抗體（美國 Cell Signaling公司）。

1.2 方法

1.2.1 糖尿病大鼠模型的復制 80只SD大鼠隨機分為兩組：模型組50只，腹腔注射STZ，72 h后隨機測量，血糖量≥16 mmol/L為復制模型成功；對照組30只，注射等體積的枸櫞酸緩沖液。在復制模型后的第3天、第1、2、4、8周5個時間點處死動物，取背部皮膚組織4份分別行糖含量、AGEs、EGFR檢測及HE染色觀察。

1.2.2 糖含量檢測 分別取等量（約0.1 g）皮膚組織塊，剪碎后加入預冷的Ba（OH）2，勻漿，3 000 r/min離心10 min后，取上清液，Beckman's 生化自動分析儀檢測糖含量[9]。糖含量計算公式如下：

糖含量（mg/g）=上清液體積（ml）×糖濃度（mmol/L）×180×103/皮膚組織塊重量（g）

1.2.3 AGEs檢測 配制皮膚膠原提取液，通過酶促反應和顯色反應，計算提取液中的羥脯氨酸含量來反映膠原含量，再用熒光分光光度計對糖基化膠原蛋白的熒光進行自顯影，通過糖基化膠原蛋白熒光值來反映AGEs含量。利用免疫組織化學和抗AGEs單克隆抗體檢測AGEs的在皮膚組織中的蓄積部位和密度。

1.2.4 免疫組織化學檢測皮膚組織中EGFR蛋白表達取下0.5 cm×0.5 cm的皮膚經4%甲醛固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、脫蠟、抗原修復，免疫組織化學染色按照試劑盒說明步驟進行，光學顯微鏡下拍照。

1.2.5 Western blotting檢測皮膚組織中pEGFR蛋白表達 提取皮膚組織中的總蛋白，SDS-PAGE電泳分離不同蛋白，將其轉移至硝酸纖維薄膜上，室溫下脫脂奶粉封閉2 h，磷酸鹽吐溫緩沖溶液（PBS-T）沖洗，加入一抗4℃過夜，再加入辣根過氧化酶標記的二抗，室溫下孵育2 h，PBS-T沖洗，辣根過氧化酶顯色，Bio-Rad Co.生物醫學圖像分析系統對硝酸纖維膜上的目的條帶進行掃描和光密度（OD）值分析。

1.2.6 組織學觀察 取0.5 cm×0.5 cm的皮膚經4%甲醛固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、HE染色，觀察皮膚形態結構及病理變化。光學顯微鏡目鏡測微尺測量皮膚表皮的厚度，測得多個部位求平均值。

1.3 統計學方法

數據分析采用SPSS 20.0統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間均數比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組大鼠平均血糖值比較

復制模型第3天，檢測各組大鼠血糖值，糖尿病模型組大鼠平均血糖值為（22.85±5.21）mmol/L，對照組平均血糖值為（8.95±2.10）mmol/L，兩組比較差異有統計學意義（t=8.238，P=0.000），糖尿病大鼠血糖值均在16.00 mmol/L以上，復制模型成功。

2.2 模型組大鼠形態

復制糖尿病模型成功的模型組大鼠2周后毛色暗黃，體重下降，皮膚變薄，尿量增多，精神萎靡。

2.3 兩組大鼠皮膚組織中的糖和AGEs含量比較

模型組大鼠皮膚組織中的糖含量和糖基化膠原蛋白熒光值均高于對照組，且模型組在第2、4、8周時與對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），模型組高于對照組（見表1）。免疫組織化學結果顯示，AGEs在大鼠背部皮膚真皮基質中大量表達，且分布廣泛，甚至連接成片，而正常大鼠表達量較少，且染色較淺。

2.4 pEGFR蛋白的表達

免疫反應呈陽性，pEGFR在皮膚組織的細胞膜和細胞內均有表達，在細胞核中也有少量表達，鏡下觀察可見糖尿病大鼠在2周后染色區域減少且淺染，隨著病程的發展，淺染區域越來越少（見圖1）。Western blotting結果見圖2，對照組與糖尿病模型組在不同時間點均有pEGFR蛋白雜交帶，說明有pEGFR的表達；OD值分析顯示：糖尿病模型組的OD值均比同一時間對照組值小，并且在第4、8周時與對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

圖1 pEGFR蛋白表達 （免疫組織化學×400）

表1 兩組大鼠皮膚中糖含量及糖基化膠原蛋白熒光值比較 （±s）

表1 兩組大鼠皮膚中糖含量及糖基化膠原蛋白熒光值比較 （±s）

組別 n 第3天 第1周 第2周 第4周 第8周糖含量/（mg/g）對照組 6 0.79±0.12 0.83±0.25 0.90±0.33 0.77±0.20 0.81±0.31模型組 10 0.89±0.11 1.02±0.39 1.45±0.56 1.76±0.67 1.98±0.69 t值 1.704 1.062 2.172 3.484 3.883 P值 0.109 0.305 0.046 0.003 0.001糖基化膠原蛋白熒光值/（u/mg）對照組 6 19.98±0.45 21.88±1.83 20.34±0.94 24.33±0.45 22.65±0.76模型組 10 23.44±0.78 24.44±0.55 28.85±1.45 30.83±0.97 34.49±0.32 t值 9.842 4.884 12.763 15.296 43.953 P值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

2.5 組織病理學觀察

圖2 兩組大鼠western blotting結果

組織切片觀察發現在第3天、第1周時皮膚結構變化不明顯，2周后表皮變薄，在第4、8周時可見復層排列部分消失（見圖3）。其厚度與對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05），見表3。真皮具有萎縮、炎癥細胞浸潤現象，皮下脂肪部分萎縮甚至消失。

表2 兩組大鼠pEGFR表達比較 （±s）

表2 兩組大鼠pEGFR表達比較 （±s）

組別 n 第3天 第1周 第2周 第4周 第8周對照組 6 5.23±0.56 5.34±0.67 5.77±1.22 5.07±0.42 5.37±1.39模型組 10 5.06±0.53 5.24±0.19 4.96±0.36 4.03±0.91 3.80±0.11 t值 -0.121 0.099 2.083 2.976 3.489 P值 4.341 0.891 1.559 0.021 0.001

圖3 大鼠組織切片 （HE×200）

表3 兩組大鼠表皮厚度比較 （μm，±s）

表3 兩組大鼠表皮厚度比較 （μm，±s）

組別 n 第3天 第1周 第2周 第4周 第8周對照組 6 20.03±0.41 19.89±0.23 21.12±0.48 21.55±0.86 21.89±0.65模型組 10 20.22±0.72 19.33±1.21 19.02±0.83 17.34±0.78 15.98±0.76 t值 0.587 1.107 5.612 10.071 15.837 P值 0.566 0.286 0.000 0.000 0.000

3 討論

近年來，糖尿病患者逐年增加，其并發癥也日益增多[10]。糖尿病可引起皮膚隱形損害，這種內源性的損害使皮膚具有易感性，使得機體免疫功能低下嚴重者可導致皮膚并發癥的產生，加重疾病治愈的難度[11]。

本研究對大鼠皮膚組織中的糖含量及AGEs進行檢測，發現皮膚組織中2種指標均增高，AGEs是由還原性糖和蛋白質或氨基酸生成的復雜混合物。免疫組織化學和Western blotting結果顯示皮膚中pEGFR表達減少，大鼠皮膚組織病理切片發現表皮變薄，并且隨時間的增加越來越明顯，出現炎癥細胞浸潤，真皮萎縮，膠原排列紊亂，皮下脂肪萎縮消失。由此可見，糖尿病大鼠由于糖代謝障礙而導致皮膚組織中糖含量增加，高糖環境進而使AGEs蓄積。有研究表明[13]，糖尿病患者皮膚組織中EGFR數量、性質發生改變。EGF并不是EGFR的唯一配體，AGEs前體物質甲基乙二醛和乙二醛均可與EGFR形成受體復合物，從而抑制EGFR磷酸化，阻礙受體酪氨酸二聚化，阻斷下游信號途徑的傳導[14]，從而導致皮膚隱性損害的產生。糖尿病患者皮膚組織中的糖含量及AGEs含量均增高，因此高糖代謝產物可拮抗性的與EGFR結合，抑制了EGF與其結合，從而阻礙其作用的發揮[15]。

綜上所述，由于pEGFR的減少而導致信號通路傳遞障礙是糖尿病造成皮膚隱性損害和皮膚并發癥發生的重要機制之一，為預防和治療糖尿病并發的皮膚病提供理論依據。