TGF-β1和β-catenin在兒童結腸息肉中的表達及意義

王松陽

（漯河市第二人民醫院 外二科，河南 漯河 462000）

兒童結腸息肉（colonic polyps）為兒童腸黏膜隆起贅生物，一般均為具有錯構瘤特征的幼年性息肉，并會誘發兒童下消化道出血。目前，兒童結腸息肉通過結腸鏡的檢查，檢出率較高。該病的發病機制還不明確，文獻認為該病的發生與遺傳因素有關，并與多個信號通路異常表達有關，為多基因參加和調控的過程[1]。

研究表明，轉化生長因子β1（transforming growth factor-β, TGF-β1）與結腸癌、肝癌等多種腫瘤發生有關，通過雙向調控影響腫瘤生物學行為[2]。而β-連環蛋白(β-catenin)作為Wnt/β-catenin通路的細胞因子，可以直接調節細胞的增殖和分化。目前有關TGF-β1和β-catenin在兒童結腸息肉中的表達、進展及機制報道較少，本研究主要分析兒童結腸息肉中TGF-β1和β-catenin蛋白的陽性表達及基因表達水平，并分析其分子機制，為兒童結腸息肉預防和治療提供依據。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2006年1月—2017年1月河南省漯河市第二人民醫院病理科存檔的兒童息肉石蠟標本54例。其中，單發幼年性息肉29例。男性18例，女性11例；年齡4～13歲，平均（6.2±1.9）歲。多發幼年性息肉25例。男性16例，女性9例；年齡4～12歲，平均（6.1±1.7）歲。收集同期標本旁組織25例，病理分析為正常組織。標本采集均告知家屬并知情同意。

1.2 主要試劑

兔抗人TGF-β1多克隆抗體（北京中杉金橋生物技術有限公司），兔抗β-catenin單克隆抗體（美國Santa Cruz公司），二氨基聯苯胺顯色試劑盒，SP法免疫組織化學（以下簡稱免疫組化）試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司），Fast-King一步法逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR）試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]。

1.3 免疫組化染色檢測TGF-β1和β-catenin的表達

常規固定標本、脫水并進行石蠟包埋，連續切片（4μm），抗原修復，采用SP法行免疫組化染色，二氨基聯苯胺顯色，鏡檢。磷酸鹽緩沖液替代一抗制作陰性對照切片。TGF-β1和β-catenin為胞漿、胞膜和/或細胞核染色，呈棕黃色顆粒狀或線狀，其中單一或混合染色即為陽性染色細胞。隨機選擇4個視野（×400）雙盲法讀片。TGF-β1的陽性診斷：胞漿和/或胞膜著色≥30%。β-catenin異常表達：胞膜著色≥70%為正常，相反為胞膜表達缺失，胞漿和/或胞核著色＞10%為異位表達，胞膜表達缺失和異位表達均為異常表達。

1.4 RT-PCR檢測TGF-β1和β-catenin mRNA的表達

Trizol提取總RNA，按照Fast-King一步法RT-PCR試劑盒說明書進行RT-PCR實驗。引物序列由上海英駿公司提供。TGF-β1（NM_000660.6）序列：正向5'-G GGCTACCATGCCAACTTCT-3'，反向 5'-GACACAGAG ATCCGCAGTCC-3'，擴增產物長度384 bp；β-catenin（X87838.1）序列：正向5'-GGCCTAGGTGTCCAAAG GTG-3'，反向 5'-AGAATGACCGCATAGTGCCC-3'，產物長度201 bp；內參GAPDH（NM_001289745.2）序列：正向5'-GAATTTGGCCACACTCAGTCC-3'，反向5'-GT ACATGACAAGGTGCGGCT-3'，長度 110 bp。

1.5 統計學方法

數據分析采用SPSS 18.0統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較采用方差分析，兩兩比較用用LSD-t檢驗。計數資料以率（%）表示，比較用χ2檢驗，相關分析用Spearman法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TGF-β1和β-catenin的表達情況

TGF-β1蛋白在正常結腸組織的腺體腺上皮細胞、間質細胞細胞膜可見少量表達，而幼年性息肉組織中表達主要位于胞膜、胞漿和/或細胞核中，呈棕黃色顆粒。β-catenin蛋白在正常結腸組織上皮細胞（包括腺體上皮細胞）膜可見少量的表達，呈棕黃色。而幼年性息肉組織中可見膜表達、胞漿表達和部分核表達。見圖1。

圖1 TGF-β1和β-catenin蛋白在兒童幼年性息肉組織中的表達 （×400）

TGF-β1在兒童多發幼年性息肉組織中的陽性表達率高于正常組織陽性表達率（P＜0.05），而單發幼年性息肉組織中的陽性表達率與正常組織陽性表達率比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。β-catenin蛋白在兒童多發幼年性息肉組織中的表達率高于正常組織表達率以及單發幼年性息肉組織中的表達率（均P＜0.05），而單發幼年性息肉組織中的表達率與正常組織比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

2.2 TGF-β1和β-catenin mRNA的表達情況

多發幼年性息肉組織中TGF-β1和β-catenin mRNA相對表達水平高于單發以及正常組，差異有統計學意義（P＜0.05）。而單發幼年性息肉組織中的TGF-β1和β-catenin mRNA相對表達水平與正常組織比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2和圖2。

表1 TGF-β1和β-catenin在兒童幼年性息肉組織中的表達

表2 TGF-β1和β-catenin mRNA的表達 （±s）

表2 TGF-β1和β-catenin mRNA的表達 （±s）

標本 n TGF-β1 β-catenin正常組 25 0.35±0.06 0.21±0.03單發息肉 25 0.38±0.06 0.23±0.03多發息肉 29 0.43±0.05 0.27±0.04 F值 13.900 21.970 P值 0.000 0.000

圖2 TGF-β1和β-catenin mRNA的表達

2.3 TGF-β1和β-catenin相關性分析

兒童多發幼年性息肉組織中T G F-β1和β-catenin的表達呈正相關（rs=0.463，P=0.000），見表3。

表3 TGF-β1和β-catenin相關性分析 （n =14）

3 討論

幼年性息肉病常易誘發潰瘍、糜爛出血。部分還出現炎癥細胞浸潤，最初的研究顯示幼年性息肉無癌變的傾向，生物學效應表現為良性[3]。但近年來部分研究顯示，幼年性息肉也具有轉化為腺瘤樣息肉惡變的風險。BOSKOVIC等[4]報道1例兒童3個息肉中伴有低級別上皮內瘤變（IEN），而國外ADOLPH等[5]認為幼年性息肉可以和腺瘤共存，這也提示幼年性息肉部分可能發生癌變。

TGF-β1為TGF-β/Smad4信號通路的多功能生長因子，能調節上皮細胞分化，協調組織重塑和細胞外基質的形成。并通過誘導細胞因子，促進細胞的生長和分化，破壞細胞基質的生長和降解平衡，促進纖維化并參與息肉的形成。郝國榮等[6]研究發現，子宮內膜息肉中TGF-β1水平高于正常子宮內膜息肉水平。LEONARDO等[7]研究發現，17例鼻息肉病患者的息肉的TGF-β1水平高于11例正常對照的鼻黏膜中TGF-β1水平。有研究顯示TGF-β1與腫瘤的發生、侵襲和轉移有關，對腫瘤具有雙向調節作用，早期抑制腫瘤的生長，而晚期主要具有促進作用[8]。而且有報道TGF-β1與乳腺癌的進展、浸潤和預后相關[9]。本研究顯示，TGF-β1在多發幼年性息肉中的陽性表達率以及TGF-β1mRNA相對表達水平均高于正常組，提示TGF-β1蛋白水平的改變與息肉的發生有關，并可能促進腺瘤、腺癌的發生，對此患兒可以詢問家族史，并采用基因檢測或腸鏡檢查。而單發幼年性息肉組織中的陽性表達率以及TGF-β1mRNA相對表達水平與正常組織陽性表達率比較無差異，提示單發幼年性息肉發生癌變的風險較低。而且TGF-β1蛋白以及基因水平在單發以及多發幼年性息肉組織中較正常組依次增加，這也證明了上述的觀點。

β-catenin對癌基因、抑癌基因具有一定的調節作用，高水平的的β-catenin容易產生降解障礙，并出現過度積聚，通過對下游基因的激活，調控細胞增殖和分化，嚴重時擾亂增殖和凋亡平衡，并最終形成腸息肉[10]。金美芳等[11]發現，兒童幼年性息肉中，β-catenin蛋白表達和分布改變明顯。目前針對腫瘤中β-catenin水平的變化研究報道較多，但針對兒童幼年性息肉中的β-catenin水平的變化研究報道較少。本研究中，多發幼年性息肉組織中的β-catenin陽性表達率以及β-catenin mRNA的相對表達水平高于正常組織和單發幼年性息肉組織中的表達水平，而單發幼年性息肉組織中的β-catenin陽性表達水平以及β-catenin mRNA的相對表達水平與正常組織異常表達率比較無差異，提示單發幼年性息肉惡變傾向較低，但不排除多發幼年性息肉癌變的風險，尤其針對有家族史的患兒需要定時的檢查和檢測，減少癌變的風險。

研究表明，TGF-β/Smad4、Wnt/β-catenin信號通路與腫瘤的發生和進展有關，并彼此影響調控細胞分化[12]。已有研究證實，TGF-β1和β-catenin共同參與、調節原發性肝癌的發生和進展，表明TGF-β/Smad4信號通路中TGF-β1在參與經典通路外，還可調節Wnt通路，并通過某些途徑共同調節基因的表達[13]。WINCEWICZ等[14]研究發現，TGF-β1與β-catenin間的聯系有差異。本研究結果表明，幼年性息肉的發生與TGF-β1和β-catenin異常表達有關，并具有正相關性，提示TGF-β1基因可能通過β-catenin途徑促進息肉的形成，尤其多發幼年性息肉中更加明顯，級聯激活TGF-β/Smad4信號通路，調控息肉組織細胞的增殖、分化和侵襲。