男性不育患者Y染色體AZF基因微缺失檢測和染色體核型分析*

張麗潔，趙 園，趙喬佳杰，王九菊，李艷春，魏緒倉

(陜西省人民醫院血液遺傳研究所，西安 710068)

目前越來越多的育齡夫婦患有不孕不育癥，其中男性方面因素約占 30%～50%，由遺傳因素導致精子生成障礙約占男性不育癥的30%[1]?？耸暇C合征(klinefelter syndrome，核型為47，XXY)和Y染色體微缺失是引起男性不育的前兩位遺傳因素?？耸暇C合征在人群中的發生率約為1/1 000，不育男性中占1/10，是發生率較高的一種性染色體病。研究證明，Y染色體上長臂1區1帶(Yq11)存在精子生成相關基因，即無精子癥因子(AZF)，分為AZFa，AZFb和AZFc 3個區域，這些區域的缺失會導致生精障礙，引起少精子癥或無精子癥[2]。

本研究對60例不育患者進行Y染色體微缺失檢測和染色體核型分析，進而在細胞和分子遺傳水平探討男性不育的原因。

1材料與方法

1.1 研究對象 收集2018年1月～2019年1月陜西省人民醫院男科門診就診的60例男性不育患者(嚴重少、弱精癥和無精癥)的全血標本，對照組為30例精液常規檢測正常的男性志愿者，年齡20～42歲。

1.2 儀器與試劑 德國ZEISS顯微鏡及染色體圖像分析系統。Roche Cobas z480熒光定量PCR儀，外周血淋巴細胞培養基(廣州市達暉生物技術有限公司)，Chromed G吉姆薩染液(上海樂辰生物科技有限公司)，外周血DNA提取試劑盒(江蘇康為世紀生物科技有限公司)，Y染色體微缺失檢測試劑盒(上海透景生命科技股份有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 Y染色體微缺失檢測

1.3.1.1 PCR反應體系：實驗操作按照上海透景科技公司的Y染色體微缺失檢測試劑盒進行，采用多重熒光定量PCR方法判斷AZFa區(sY84，sY86)，AZFb區(sY127，sY134)和AZFc區(sY254，sY255)的6個序列標簽位點(STS)的微缺失，同時設置男性性別決定基因(SRY)和編碼鋅指蛋白基因(ZFX/ZFY)為兩個內對照基因。SRY，sY84，sY127和sY255為組別A，ZFX/ZFY，sY86，sY134和sY254為組別B。4種熒光標記FAM，VIC，ROX和Cy5分別對應內對照(SRY，ZFX/ZFY)，AZFa(sY84，sY86)，AZFb(sY127，sY134)和AZFc(sY254，sY255)。

1.3.1.2 PCR擴增反應條件：第一階段： 50℃ 2 min，95℃ 5 min；第二階段95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，38個循環，在每個循環的60℃時收集FAM/VIC，ROX和Cy5信號；第三階段72℃延伸5 min。

1.3.1.3 結果判讀：通過分析擴增曲線判讀結果，出現典型的S型擴增曲線且Ct值小于32表示基因表達正常，否則表示缺失。

1.3.2 染色體核型分析

1.3.2.1 染色體核型標本制備：采用常規細胞遺傳學方法進行外周血淋巴細胞培養和G顯帶染色體核型標本制備。

1.3.2.2 核型分析：采用Ikaros核型分析系統軟件計數20個中期分裂相，采集5個中期分裂相以分析核型。

2結果

2.1 不育患者Y染色體AZF基因微缺失結果分析 60例男性不育患者中Y染色體AZF基因缺失的有2例，檢出率為3.33%，且均為AZFc區的sY254，sY255位點缺失。30例精液常規檢測正常的志愿者未檢測到AZF基因缺失。

2.2 60例不育患者的染色體核型分析結果 在60例嚴重少精癥和無精癥的不育患者中檢出5例異常核型(占8.33%)，均為克氏綜合征(47，XXY)，其中3例患者還出現乳房發育和激素水平的異常，即卵泡刺激素(FSH)、黃體生成素(LH)、泌乳素(PRL)的水平異常增高和睪酮(TT)水平下降等。該5例染色體異?；颊叩腨染色體AZF基因并無缺失。

3討論很多原因會導致男性不育，遺傳性因素致生精障礙引起的不育占30%，臨床上主要表現為嚴重少、弱精癥和無精癥。目前臨床對男性不育的鑒別大多基于常規精液分析和血清生殖激素的測定，但這些檢測并不能明確患者是否具有生育能力及對后代的影響，因而開展細胞和分子遺傳檢測對患者的診斷和治療具有重要意義[3-4]。

克氏綜合征和Y染色體微缺失是導致精子發生障礙的主要遺傳性缺陷?？耸暇C合征患者臨床多表現為身材高大、睪丸小、第二性征發育不良、不育等，典型病例的血漿睪酮僅為正常人的一半，個別患者睪酮正常。外周血染色體核型分析是診斷克氏綜合征的主要實驗依據。本文對60例不育男性患者的染色體核型分析結果與陳琨等[5]對574例男性不育患者的核型研究結果一致，即不育男性中約有8%為克氏綜合征患者。

Y染色體微缺失發生的區域不同，不育患者的臨床表型也有所不同，因此明確Y染色體微缺失有無及缺失位點類型有助于臨床醫師為不育患者選擇最佳的治療方案。AZFa缺失發生頻率最低，一般表現為無精癥和唯支持細胞綜合征(SCOS)，此類患者不建議做單精子胞漿內注射手術(ICSI)；AZFb，AZFb+c缺失可導致SCOS或生精阻滯，也不建議做ICSI；AZFc缺失最為常見，表現為嚴重少精癥或無精癥，該類患者尚存精子生成能力，可通過ICSI等輔助生育手段獲得后代，建議生女孩，避免AZFc缺失在男性后代的傳遞[6-7]。目前國內不同地區研究者報道的AZF基因微缺失發生率有所不同。曹金如等[8]對東莞地區的120例不育患者的Y染色體AZF基因微缺失的檢測中發現23例AZFc區缺失，檢出率為19.2%，未發現其它區域缺失。樊冰等[9]通過對深圳地區180例男性不育患者的Y染色體微缺失的分析發現18例AZFc缺失，2例AZFb+c缺失，缺失檢出率為11.11%。韓瑞玲等[10]發現346例男性不育患者中有17例Y染色體微缺失，缺失檢出率為4.9%。本研究中的Y染色體微缺失檢出率偏低，這可能與地域差別，或選擇的STS位點有關，且此次分析的標本量偏少，有待后續研究中增加標本量進一步探討Y染色體微缺失與男性不育的相關性。

綜上所述，遺傳缺陷導致的精子生成障礙是男性不育的重要因素。染色體核型分析和Y染色體AZF基因微缺失檢測有助于篩查男性不育的原因，為醫師對不育男性的合理診療提供依據。