艾拉莫德對類風濕關節炎外周血破骨細胞分化及破骨細胞相關基因表達的影響

馮佳 龔書識 夏燕 田瑞 楊年安 趙小丹 蔡德慧 向陽 袁林*

1. 湖北民族學院風濕性疾病發生與干預湖北省重點實驗室，湖北 恩施 445000 2. 湖北民族學院附屬民大醫院，湖北 恩施 445000

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以滑膜炎、軟骨和骨破壞為特征的慢性炎癥性自身免疫性疾病[1]。RA發病后半年內即可發生不可逆的關節滑膜損傷，并出現炎性關節附近的骨量丟失，兩年內即可出現軟骨下骨質的破壞及全身范圍的骨量流失，逐漸發展為關節活動受限[2]。研究發現，在RA患者和CIA關節炎大鼠骨質破壞處發現大量活化的破骨細胞和成熟破骨細胞[3]，提示破骨細胞的分化和成熟可能是導致RA骨破壞的重要環節。艾拉莫德(Iguratimod)是一種新型小分子緩解病情抗風濕藥物[4]，研究認為其通過抑制細胞免疫及體液免疫，達到治療RA的療效，在臨床得到廣泛使用。近年來發現艾拉莫德還可以改善RA患者的骨代謝狀況：Shin D[5]等運用動物模型、Gan K[6]等以RAW264.7細胞模型進行研究發現艾拉莫德通過抑制核因子-κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)的激活促進骨形成和抑制骨破壞。本研究通過觀察不同濃度艾拉莫德對RA患者外周血單個核細胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)所誘導破骨細胞的分化與骨吸收的影響，探討破骨細胞在RA骨質破壞中的作用及艾拉莫德防治RA可能的分子機制，為RA的治療提供新途徑、新思路。

1 材料與方法

1.1 病例資料

選取2017年3月至2017年10月在湖北民族學院附屬民大醫院風濕科住院治療的RA患者20例,女性17例,男性3例,年齡46±14歲。診斷均符合2010年歐洲抗風濕聯盟/美國風濕病協會(EULAR/ACR)分類標準。且患者均未接受過艾拉莫德治療，均無合并嚴重心、肝、腎疾病、惡性腫瘤、糖尿病等疾病。本研究經醫院醫學倫理學委員會批準，所有研究對象均簽署書面知情同意書。

1.2 藥物與試劑

艾拉莫德(先聲藥業公司)每片25 mg，溶解在1 mL的DMSO中，使用時用1640培養基稀釋。RANKL及M-CSF均購自美國Pepro Tech公司，用含10%FBS的1640培養基配成濃度為100 ng/mL RANKL和50 ng/mL M-CSF的誘導培養液。Ficoll-paque PLUS及TRAP染色試劑盒購自GE公司，RPMI 1640培養基、胎牛血清購自美國GIBCO公司，Cell Counting Kit-8(CCK-8)購自東仁化學科技有限公司，TRIzol Reagent購自Ambion公司，Prime Script RT reagent kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)及 SYBR Premix Ex Taq(Tli RNase H Plus)購自TaKaRa公司，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.3 實驗儀器

OD-1000+超微量分光光度計、LC480實時熒光定量PCR儀購自Roche公司，BX50熒光顯微鏡購自Olympus公司。

1.4 試驗方法

1.4.1外周血單個核細胞(PBMCs)的分離及破骨細胞的誘導

采患者空腹靜脈血5 mL入肝素抗凝管中，采用Ficoll密度梯度離心方法分離外周血單個核細胞，用含10%FBS的1640培養液將細胞濃度調整為2×106/mL。將收集的PBMCs細胞懸液接種于24孔培養板中，每孔加入0.5 mL懸液。在細胞培養箱培養24 h后，輕輕吸除培養孔中培養液，沿孔壁緩慢加入0.5 mL誘導培養液，隔兩天換1次誘導培養液，連續培養14天。

1.4.2破骨細胞的鑒定

顯微鏡下觀察貼壁細胞的生長形態、細胞分化融合形成多核細胞的情況。按照TRAP 染色試劑盒說明書進行染色。顯微鏡下觀察含有3個及以上細胞核且TRAP染色陽性的多核巨細胞為破骨細胞。200倍光鏡下隨機選l0個視野，計數破骨細胞數量，結果用個/10個視野表示，每孔重復計數3次，取其均數。

1.4.3CCK-8 檢測艾拉莫德對PBMC的毒性作用

將分離的RA患者PBMCs 用培養液配制成5×105/mL的細胞懸液，接種于96孔培養板中，37 ℃，5%CO2培養箱中培養過夜。待細胞貼壁后，去除培養基，分別加入含不同濃度艾拉莫德的培養基各100 μL，在培養24、48、72 h后，向每孔中加入10 μL CCK-8溶液，將培養板在培養箱內孵育1.5 h。用酶標儀測定各組在450 nm波長處的吸光度OD值，計算細胞活力。

1.4.4艾拉莫德對RA患者PBMC生成破骨細胞的影響

將收集的RA患者PBMCs配制成2×106/mL細胞懸液，接種于24孔培養板中，每孔加入0.5 mL，37 ℃，5%CO2培養箱內培養24 h。分為4組：對照組、艾拉莫德25μg/mL實驗組、艾拉莫德12.5μg/mL實驗組、艾拉莫德6.25μg/mL實驗組，艾拉莫德各實驗組加入含不同濃度艾拉莫德的誘導培養液培養，對照組為不含艾拉莫德的誘導培養液，隔兩天換1次誘導培養液，連續培養14天。TRAP染色。

1.4.5艾拉莫德對RA患者外周血破骨細胞TRAP、CTSK、RANK、AP-1 mRNA表達的影響

收集各組細胞，按照TRIzol Reagent說明書提取RNA，測定RNA純度及濃度，A260/A280比值為1.8～2.0。合成cDNA: 5×gDNA Eraser Buffer 2 μL、gDNAEraser 1 μL、總RNA 1μg，42 ℃ 2 min; 5 × Prime Script Buffer 4 μL、Prime Script RT Enzyme Mix I 1 μL、RT Primer Mix 1 μL、無RNA酶dH2O 4 μL，37 ℃ 15 min，85 ℃ 5s; cDNA儲存于-20 ℃。實時熒光定量RCP檢測TRAP、CTSK、RANK、AP-1 mRNA的表達，GAPDH為內參基因。反應體系10 μL:SYBR Premix Ex Taq 5 μL、上游引物0.3 μL、下游引物0.3 μL、模板1 μL、dH2O 3.4 μL。反應條件：95 ℃ 預變性30 s、95 ℃變性5 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，40個循環。基因表達量以2-△△CT表示實驗組目的基因表達相對于對照組變化的倍數。

1.4.6統計學分析

2 結果

2.1 破骨細胞誘導形態學觀察

PBMCS培養24 h后，部分細胞貼壁,為單核細胞(見圖1 A)；誘導培養第3天，出現少數單個核成纖維樣細胞生長(見圖1B)；培養第8天，成纖維樣細胞明顯增多，可見少數多核細胞，圓形或不規則形(見圖1C)；培養第14天出現較多多核細胞，胞體較其他細胞大，折光性強，形似油煎蛋形樣或長條狀(見圖1D)。

圖1 顯微鏡下細胞形態觀察(200×)A: 24小時 B: 第 3 天 C: 第 8 天D: 第14天Fig.1 Observation of the cell morphology (200×)A: 24 h; B: the 3nd day; C: the 8th day; D: the 14th day

2.2 破骨細胞鑒定結果

將誘導培養14天的細胞進行TRAP染色，顯微鏡下可見大量多核細胞, 胞核3～20個不等,胞質內有紫紅色顆粒樣沉淀,即為破骨細胞。(見圖2)

圖2 破骨細胞 TRAP 染色(A: 100倍 B: 200倍)Fig.2 TRAP staining of the osteoclasts (A: 100×; B: 200×)

圖4 不同濃度艾拉莫德對RA患者破骨細胞的影響A.對照組;B.艾拉莫德25μg/mL組;C.艾拉莫德12.5μg/mL組;D.艾拉莫德6.25μg/mL組Fig.4 Effects of different concentrations of Iguratimod on osteoclasts in RA patientsA. Control Group; B. Iguratimod 25μg/mL Group; C. Iguratimod 12.5μg/mL Group; D. Iguratimod 6.25μg/mLGroup

2.3 艾拉莫德對PBMCs的毒性作用

CCK-8檢測結果顯示艾拉莫德25μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL三個濃度對PBMCs細胞活力無明顯影響(圖3所示)。

2.4 艾拉莫德對RA患者PBMCs生成破骨細胞的影響

不同濃度艾拉莫德干預RA患者PBMCs生成破骨細胞，結果顯示艾拉莫德6.25 μg/mL組、12.5 μg/mL組、25 μg/mL組的破骨細胞數量均明顯低于對照組(P<0.05)。(圖4，圖5所示)

圖3 艾拉莫德對PBMCs細胞活力的影響Fig.3 The effect of Iguratimod on the activity of PBMCs

圖5 艾拉莫德對RA患者破骨細胞數量的影響注：* P<0.05Fig.5 The effect of Iguratimod on the number of osteoclasts in RA patients. Note:* P<0.05

2.5 艾拉莫德對RA患者外周血破骨細胞TRAP、CTSK、RANK、AP-1 mRNA表達的影響

艾拉莫德6.25 μg/mL組、12.5 μg/mL組、25 μg/mL組破骨細胞TRAP mRNA表達分別為對照組的0.4271、0.1468、0.1306倍；CTSK mRNA表達分別為對照組的0.812、0.106、0.0957倍；RANK mRNA表達分別為對照組的0.891、0.538、0.411倍；AP-1 mRNA表達分別為對照組的0.736、0.1083、0.0957倍。說明艾拉莫德能抑制TRAP、CTSK、RANK、AP-1 mRNA的表達水平，且隨艾拉莫德濃度的升高抑制作用越明顯，與對照組相比，差異均具有統計學意義(P<0.05)。(圖6所示)

圖6 艾拉莫德對RA患者外周血破骨細胞相關基因表達的影響A.TRAP mRNA B.CTSK mRNA C.RANK mRNA D.AP-1 mRNA注：*P<0.05Fig.6 Effect of Iguratimod on the expression of osteoclast-related genes in RA patientsA. TRAP mRNA; B. CTSK mRNA; C. RANK mRNA; D. AP-1 mRNANote:*P<0.05

3 討論

骨侵蝕是RA的主要特征,而破骨細胞是骨侵蝕發生的關鍵環節[7]。破骨細胞是一種終末分化的多核巨噬細胞，來源于單核/巨噬細胞系統[8]。單核巨噬破骨細胞前體細胞和部分外周血單核細胞在骨組織中被激活，聚集并粘附于骨表面, 各種細胞因子和自身抗體刺激破骨細胞的活化，并通過分泌酸和溶解酶來降解骨基質, 從而促進骨吸收[9]。RANKL和M-CSF是破骨細胞形成的主要細胞因子,RANKL調節破骨細胞的分化和激活,促進破骨細胞遷移;M-CSF與受體c-fsm結合,促進破骨前體細胞的再生[10]。TRAP是破骨細胞特有的一種酶，破骨細胞溶酶體膜有較高的TRAP作用，在含酒石酸的酸性條件下，將產生的萘酚磷酸鹽水解物與染色劑結合，在酶的活性部位形成不溶的紅色沉淀，TRAP染色陽性為破骨細胞的典型標志[11]。研究發現[12]RA患者外周血生成破骨細胞的數量顯著高于健康對照組，RA患者的骨吸收活性也明顯高于對照組，認為外周血破骨細胞可能是反映RA患者關節骨質破壞的重要指標。本實驗使用100 ng/mL RANKL和50 ng/mL M-CSF誘導破骨細胞的形成, 在第8天出現少數多核細胞,第14天出現較多多核細胞,TRAP染色陽性,成功將RA患者PBMCs誘導為破骨細胞。

艾拉莫德是由國家食品藥品監督管理局臨床批準的Ⅰ類新藥，用于治療成人活動性RA[13]。多項基礎研究發現，艾拉莫德通過抑制與RA病情活動密切相關的促炎因子，起到控制RA及RA引起骨流失的雙重效果，艾拉莫德還能顯著抑制CIA大鼠模型骨吸收和關節破壞，證實艾拉莫德具有減輕RA骨破壞的作用[14]。本實驗使用不同濃度艾拉莫德作用于PBMCs,發現艾拉莫德25 μg/mL、12.5 μg/mL、6.25 μg/mL三個濃度對PBMCs細胞無明顯細胞毒性作用,在此基礎上,使用上述三個濃度艾拉莫德干預RA患者PBMCs生成破骨細胞，結果顯示艾拉莫德實驗組均能抑制破骨細胞的生成,其中艾拉莫德25 μg/mL組抑制作用最為顯著。

Rank是腫瘤壞死因子受體超家族成員之一,表達于破骨細胞及前體細胞膜表面,與成骨細胞產生的RANKL結合，啟動下游信號轉導，刺激破骨細胞前體細胞分化為破骨細胞，促進骨吸收。轉錄因子AP-1是破骨細胞分化的主要調節因子[15],調整破骨細胞相關基因的表達,如TRAP, CTSK等,在破骨細胞活化中起重要作用[16]。研究表明RA患者破骨細胞活性增加對全身性骨量丟失發揮著重要作用[17]。本實驗通過觀察不同濃度艾拉莫德對RA患者外周血破骨細胞相關基因表達的影響,發現艾拉莫德能抑制TRAP、CTSK、RANK、AP-1 mRNA的表達水平，且隨艾拉莫德濃度的升高抑制作用越明顯,與顯微鏡下觀察結果一致。

綜上,艾拉莫德具有體外抑制RA患者PBMCs向破骨細胞分化的作用，能夠抑制RA患者外周血破骨細胞TRAP、CTSK、RANK、AP-1 mRNA的表達，且均呈濃度依賴性。RA骨平衡的紊亂主要是由破骨細胞所驅動, 艾拉莫德通過抑制破骨細胞，阻止RA骨質破壞，成為RA臨床治療的新選擇。