60Co-γ射線對2種狼尾草屬牧草的誘變效應

武炳超，童磊，杜昭昌，胡家菱，張歡，陳燚，劉偉，張新全，黃琳凱

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60Co-γ射線對2種狼尾草屬牧草的誘變效應

武炳超，童磊，杜昭昌，胡家菱，張歡，陳燚，劉偉，張新全，黃琳凱

（四川農業大學草業科學系，成都 611130）

【目的】探究60Co-γ射線對“熱研4號”雜交狼尾草及“華南”象草的誘變效應，創制新種質，以推動狼尾草的育種工作。【方法】在前期劑量篩選基礎之上，以2種狼尾草品種（“熱研4號”雜交狼尾草和“華南”象草）種莖為材料，利用60Co-γ射線進行輻射，劑量為30 Gy，劑量率為1 Gy·min-1。將輻射后的種莖與未輻射的種莖栽植于大田中，常規田間管理，1個月后統計成活率。待成活的植株生長成熟后，在2個誘變系群體中分別隨機挑選30株進行形態指標的測定，共測定7個指標。隨后利用分子標記探究輻射對遺傳變異的影響。【結果】2個品種的輻射材料，分別隨機選取30株進行形態指標測定，與對照相比，發現“熱研4號”誘變系中有28株的株高，21株的莖節數及17株的葉寬有顯著或極顯著差異。“華南”誘變系中有20株的株高有顯著或極顯著差異，其他形態指標差異不大。2種牧草的突變體大都表現出株高的降低，因此，生物量也隨之減少。還發現一個輻射材料RY4-17，由于分蘗數多于對照導致生物量增加。SSR分子標記研究結果表明，在“熱研4號”誘變系中，20對引物的平均多態信息含量為0.245，共擴增出83條帶，其中多態性條帶52條，誘變系與對照之間的遺傳相似系數為0.67—0.89，平均值為0.81，差異位點數為9—27，平均為15.9個，UPGMA聚類結果顯示突變體RY4-9和RY4-23與對照遺傳距離最遠，變異程度最大。在“華南”誘變系中，20對引物的平均多態信息含量為0.394，共擴增出81條帶，其中多態性條帶65條，誘變系與對照之間的遺傳相似系數為0.54—0.86，平均值為0.77，差異位點數為10—38，平均為18.8個，UPGMA聚類結果顯示突變體HN-24與對照遺傳距離最遠，變異程度最大。【結論】適宜劑量的60Go-γ射線輻射可以使2種牧草種莖成活率顯著降低，同時可以有效誘導2種牧草在形態學和遺傳學水平上發生變異。60Go-γ射線輻射誘變是解決狼尾草因無性繁殖為主而導致遺傳資源多樣性匱乏的有效途徑。

狼尾草；60Co-γ射線；表型變異；遺傳變異；SSR分子標記

0 引言

【研究意義】狼尾草屬（Rich）屬于禾本科（Poaceae）黍亞科（Panicoideae A. Br.）的一年生或多年生草本植物，全球約140種，多數原產于非洲[1]。其中雜交狼尾草（×）是以二倍體美洲狼尾草（）和四倍體象草（）雜交產生的三倍體雜交種，生產上多采用無性繁殖或者雜交一代的種子繁殖[2-3]。雜交狼尾草生產速度快，產量高，氨基酸含量比較平衡，并且耐旱，抗倒伏，極少有病蟲害發生，是一種喂養畜禽的優質飼料[4]。象草是一種莖稈粗高、含糖量大、粗蛋白和無氮浸出物含量高的優質牧草[5]，通常調制成干草或作為青刈飼料、青貯料喂養家畜[6]。20世紀90年代美國研究發現象草可作為能源植物生產乙醇、沼氣和電能[7-10]，也有人將象草看作一種保護生態和美化環境的植物[11-12]。關于狼尾草屬牧草的育種研究工作，美國一直處于領先地位，而中國目前國審象草品種只有6個，其中4個為引進品種，而國審雜交狼尾草品種僅有3個，品種資源的極度匱乏大大阻礙了這兩種狼尾草屬牧草的利用。象草具有不能形成花粉或雌蕊發育不良的缺點，通常不結實或結實率低，種子活性低，因此，生產上多用象草種莖繁殖后代[13-14]。而雜交狼尾草由于無法產生種子，生產上需要年年制種或利用種莖無性繁殖。這種以無性繁殖為主的繁殖方式大大降低了種質遺傳資源多樣性，給2種牧草的育種工作帶來困難。【前人研究進展】輻射誘變作為一種有效地增加遺傳多樣性的手段，已被證明造成的變異是可以穩定遺傳的[15]，該方法已被廣泛應用于農作物新品種選育上，但是在牧草上的應用起步較晚。2011年，福建農作物品種審定委員會審定通過了“閩牧6號”品種，該品種是通過輻射雜交狼尾草種子和田間雙重篩選選育的狼尾草新品種[16]。除此之外，多數牧草的輻射誘變研究都停留在比較基礎的階段，劉天增等[17]利用60Co-γ射線輻射海濱雀稗（）的種莖，初步選育出9個在形態指標上均不同程度優于對照的突變體材料。翁伯琦等[18]通過60Co-γ射線對決明屬（spp.）牧草輻射后代的研究發現3個突變體的生物量都比原種有所增加，氨基酸營養成分也呈現出較大的變化。而60Co-γ射線對狼尾草種莖的誘變效應的研究還未見報道。【本研究切入點】目前，分子標記已成為植物遺傳多樣性鑒定的重要工具。其中SSR（simple sequence repeats）分子標記作為一種共顯性標記，因其穩定性好、多態性高等優點，廣泛用于群體遺傳結構分析和遺傳多樣性的研究[19-21]。目前，對于狼尾草莖稈適宜輻射劑量以及所產生的誘變效應仍未探明，阻礙了該類牧草輻射誘變育種的工作進程。【擬解決的關鍵問題】本研究通過對2種狼尾草屬牧草種莖進行大量輻射，隨后對成熟突變體植株進行形態學測定，并利用SSR標記檢測誘變系與對照植株分子水平上的差異，以期探究60Co-γ射線對2種狼尾草屬牧草的誘變效應，創制優異新種質。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為種植在四川農業大學崇州實驗基地狼尾草種質資源圃中的“熱研4號”雜交狼尾草（品種登記號：196）和“華南”象草（品種登記號：066）。種質資源來自于熱帶農業科學院牧草種質基因庫，均為同一無性系擴繁，保證遺傳背景一致。挑選成熟健康、長勢相近的植株割取種莖，以含有2—3個莖節為標準。

1.2 60Co-γ射線輻射誘變

2017年4月，將割取的種莖送往四川省農業科學院輻射中心，運送過程中保持種莖濕潤，減少種莖離體脫水受到的損傷。選用劑量為30 Gy的60Co-γ射線對種莖進行輻射，劑量率為1 Gy·min-1[22]。“熱研4號”輻射406根種莖，28根未經輻射處理的莖節作為對照；“華南”輻射390根種莖，34根未經輻射處理的莖節作為對照。將輻射后的種莖種植于四川農業大學崇州實驗基地，莖稈斜插入土壤，以土壤埋沒一個莖節為標準，株距1 m，行距1 m，采用常規大田管理措施，1個月后統計成活率。

1.3 形態指標測定

等待存活的植株生長成熟后，對2種狼尾草屬牧草群體中各自隨機挑選30株突變體和3株對照進行編號（表1和表2）和7種形態指標測定，包括分蘗數、株高、莖節數、莖粗、葉寬、葉長和生物量。其中，葉寬與葉長2項指標均選取從下至上倒數第2片葉子進行測量，葉寬以葉片最寬處的測量數據為準。除分蘗數和生物量以外，其余指標均重復測量10次，分蘗數不足10個的植株，則以最大可測量指標數為準。

1.4 SSR分子標記

1.4.1 DNA提取 在測定形態指標的66個單株上選取生長良好的葉片，使用天根植物基因組DNA提取試劑盒提取DNA，并經0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測其質量，通過核酸蛋白質檢測儀檢測其純度和濃度，-20℃保存備用。使用時用TE將濃度稀釋至20 ng·μL-1，4℃保存。

1.4.2 引物篩選 2種材料單獨篩選引物，各自隨機挑選5個突變體和1個對照材料用于篩選引物，70對引物由WANG等[23]象草Survey測序開發，引物合成交由上海生工生物工程技術服務有限公司完成。將擴增后條帶清晰且突變體與對照之間存在差異的多態性引物用于后續研究。

1.4.3 PCR擴增及電泳 PCR反應體系為20 ng·μL-1，DNA 1.5 μL、Taq酶0.3 μL、Master Mix 7.5 μL、10 pmol·μL-1上游引物和下游引物各0.6 μL和ddH2O 4.5 μL。PCR反應程序為94℃5 min；94℃30 s，58℃45 s，72℃1 min，35個循環；72℃7 min，4℃保存。產物用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，染色。

1.4.4 數據統計與分析 使用Microsoft Excel 2016軟件處理66個單株的形態指標數據，并繪制相關圖表，采用SPSS 19.0軟件進行方差分析。對電泳得到的膠片進行標準化處理，即在相同遷移位置，對穩定且清晰的條帶進行統計，有帶記為“1”，無帶記為“0”，建立原始矩陣。根據統計結果，利用Microsoft Excel 2016統計SSR擴增產物的條帶總數（total number of bands，TNB）和多態性條帶數（number of polymorphic bands，NPB），并計算多態性條帶比率（percentage of polymorphic bands，PPB）和引物的多態信息含量（polymorphism information content，PIC）。利用NTSYSpc2.1（Version2.10s）軟件計算遺傳相似系數（genetic similarity coefficient，GSC）并繪制UPGMA（unweighted pair-group method with arithmetic means）聚類圖。

2 結果

2.1 輻射后種莖成活率分析

796根種莖經過30 Gy的60Co-γ射線輻射后，共獲得239株存活的植株，其中“熱研4號”的存活數為114株，成活率為28.01%，對照的存活數為22株，成活率為78.57%；“華南”的存活數為125株，成活率為32.05%，對照的存活數為29株，成活率為85.29%。

2.2 2個誘變系群體的表型變異

2.2.1“熱研4號”突變體表型的鑒定 隨機挑選30株經誘變存活的“熱研4號”進行形態測定，與對照相比，30株突變體植株均至少有一項形態指標存在顯著或極顯著差異（表1）。其中28株的株高、21株的莖節數以及17株的葉寬存在顯著或極顯著差異，分別占總數的93.3%、70%和56.7%。而葉長和莖粗分別有4株和9株呈顯著或極顯著差異，僅占總數的13.3%和30%。經分析發現，與對照相比，多數突變體的株高、莖節數呈不同程度的降低或減少，可能造成大部分突變體生物量降低。

表1 “熱研4號”雜交狼尾草突變體形態指標

*代表在0.05水平差異顯著；**代表在0.01水平差異極顯著。下同

* and ** indicate significant differences at 0.05 and 0.01 levels, respectively. The same as below

2.2.2 “華南”突變體表型的鑒定 隨機挑選30株經誘變存活的“華南”進行形態測定，與對照相比，有28株至少有一項形態指標存在顯著或極顯著差異（表2）。其中有20株株高存在顯著或極顯著差異，占66.7%，而莖節數、莖粗、葉長與葉寬等指標存在顯著或極顯著差異的植株數分別為2、7、7和11株，占總數的6.7%、23.3%、23.3%和36.7%。經分析發現，與對照相比，多數突變體株高呈不同程度降低，而其他形態指標差異不大。其中HN-12、HN-13和HN-23 3個突變體的各項形態指標均比對照高，生物量也高于對照。

表2 “華南”象草誘變系形態指標

2.3 SSR分子標記

2.3.1 SSR引物多態性 2種狼尾草屬牧草單獨篩選引物，其中“熱研4號”篩選出的20對引物，共擴增出83條清晰穩定的條帶，其中多態性條帶52條，占比62.7%。每一對引物擴增出2—8條條帶，平均擴增4.2條，擴增多態性條帶為0—6條，平均擴增2.6條。多態信息含量（PIC）為0—0.76，平均為0.245，其中引物SSR43的PIC最大，SSR24、SSR53和SSR70的PIC最小（表3）。“華南”篩選出的20對引物共擴增出81條清晰穩定的條帶（圖1），其中多態性條帶65條，占比80.2%。每一對引物擴增出2—8條帶，平均擴增4.1條，多態性條帶2—7條，平均擴增3.3條。PIC為0.04—0.76，平均為0.394，其中引物SSR53的PIC最大，而SSR66的PIC最小（表4）。其中SSR19、SSR24、SSR43、SSR47、SSR50、SSR53、SSR54、SSR55和SSR59共9對引物在2種狼尾草屬牧草中均可以擴增出清晰條帶。

表4 “華南” 20對SSR引物序列及其擴增結果

2.3.2 遺傳相似性分析 通過計算2種狼尾草屬牧草誘變系與其對照之間的遺傳相似系數（表5），發現“熱研4號”誘變系材料與對照之間的遺傳相似系數為0.67—0.89，平均值為0.81。“華南”誘變系材料與對照之間的遺傳相似系數為0.54—0.86，平均值為0.77。2種牧草誘變系中，突變體RY4-9和HN-24與各自對照的遺傳相似系數最小，說明它們與對照的遺傳差異最大，而突變體RY4-20和HN-27與各自對照的遺傳相似系數最大，說明它們變異程度最小。

2.3.3 SSR標記位點差異分析 根據擴增條帶，統計2種誘變系群體與對照之間的差異位點數（表6）。“熱研4號”誘變系與對照的差異位點數為9—27，平均15.9個，其中突變體RY4-9的差異位點數最多，為27個，差異位點百分率為32.5%，說明該突變體與對照間的遺傳差異最大。“華南”誘變系與對照間的差異位點數為10—38，平均18.8個，其中突變體HN-24與對照間的遺傳差異最大，差異位點數最多，為38個，差異位點百分率為46.9%。以上結果與遺傳相似性分析的結果一致。

表5 誘變系與對照材料間的遺傳相似系數

2.3.4 UPGMA聚類分析 通過對2種狼尾草屬牧草誘變系進行非加權平均法（UPGMA）聚類分析（圖2），發現“熱研4號”突變體RY4-9和RY4-23與對照遺傳距離最遠，在遺傳相似系數為0.72時與其他材料分開，聚為兩類，說明其變異程度最大。“華南”突變體HN-24與對照遺傳距離最遠，在遺傳相似系數為0.53時，單獨聚為一類，是變異程度最大的突變體。

表6 對照材料與誘變系間的SSR標記位點差異

3 討論

3.1 60Co-γ射線對2種狼尾草屬牧草種莖成活率的影響

近年來，利用γ射線輻射牧草的研究多集中于小型禾本科或豆科牧草[24]。本研究中2種狼尾草屬牧草均屬于高大型禾本科牧草，考慮到成本與效率，選擇用莖稈作為輻射材料。前人研究發現輻射劑量過小，可以保證植株成活率，但誘變效率低，輻射劑量過大又會導致較高的死亡率，所以確定所選的輻射劑量是否接近臨界劑量或半致死劑量顯得尤為重要[25]。本試驗基于前期研究工作選用30 Gy的60Co-γ射線對406根“熱研4號”王草種莖和390根“華南”象草種莖進行輻射，2種牧草輻射后代成活率分別為28.01%和32.05%，各自對照的成活率分別為78.57%和85.29%，該結果相較之前的研究結果有所下降，但仍然接近于臨界劑量。分析原因可能是本次輻射的材料數量規模較大，在運輸過程中增加了莖稈受到其他外源傷害的可能性，從而使成活率有所降低。

M：Marker；CK：對照；1—30：“華南”象草誘變系材料

3.2 60Co-γ射線對2種狼尾草屬牧草表型的影響

通過分析2種牧草形態變異，發現“熱研4號”誘變系中超過半數的突變體在株高、莖節數和葉寬3項形態指標上與對照材料有顯著或極顯著差異，而葉長和莖粗變化相對較小。其中突變體RY4-17有31個分蘗，遠遠高于對照，雖然其株高、莖節數和葉寬比對照降低，但是生物量略高于對照，該植株可能朝著矮小多分蘗型方向變異；“華南”象草誘變系中，多數突變體的株高與對照間差異較大，而其他形態指標差異不大，不過也有少數發生有益突變的植株，例如HN-12、HN-13和HN-23 3個突變體的各項形態指標均比對照高。研究得到的結果與前人研究結果基本一致，既輻射誘變會使生物產生大量的有害突變，例如植株矮小化和生物量降低[26]。宣繼萍等[27]利用60Co-γ射線輻射狗牙根（）后，發現狗牙根草層高度顯著降低，同時還對狗牙根的葉寬、葉長及節間直徑有顯著影響。張彥芹等[28]利用60Co-γ射線輻射高羊茅（）分化苗，得到葉片變細、變小的的突變體。此外，還發現“熱研4號”雜交狼尾草與“華南”象草相比較，在植株表型上更容易發生突變，分析可能是因為2種牧草倍性不同導致對60Co-γ射線耐受性不同，四倍體對60Co-γ射線的耐受性強于三倍體，但該假設還需要通過進一步研究來驗證。

3.3 60Co-γ射線對2種狼尾草屬牧草分子遺傳水平的影響

SSR標記作為一種共顯性標記，具有重復性高、特異性強、多態性豐富和操作簡單的特點，已經廣泛用于品種鑒定，指紋圖譜構建，親緣關系鑒定等方面[29-32]。于立偉等[33]利用385對SRR標記對2個玉米（）突變體和野生型進行變異分析，證明遺傳差異真實存在。抗旱甜菜（）突變體的鑒定也用到了這種技術[34]。本研究利用篩選出的SSR引物分別對2種牧草誘變系群體隨機挑選的30株植株進行分子水平上的鑒定，發現“熱研4號”誘變系與對照之間的遺傳相似系數為0.67—0.89，差異位點數為9—27，而“華南”誘變系與對照之間的遺傳相似系數為0.54—0.86，差異位點數為10—38。同時UPGMA聚類圖表明2個誘變系群體與各自對照之間存在遺傳距離，說明2種牧草在受到30 Gy的60Co-γ射線輻射后，在分子水平上均出現了不同程度的變異，并且推測這種變異多數是由于一些遺傳片段的缺失導致的（圖1）。

圖2 誘變系的UPGMA聚類圖

4 結論

受30 Gy60Co-γ射線輻射后，2種狼尾草種莖的成活率大大降低，但同時有效誘導2種狼尾草在形態學和遺傳學水平上產生變異。對于以無性繁殖為主而導致遺傳資源多樣性匱乏的狼尾草而言，使用適宜劑量的60Co-γ射線進行輻射誘變是解決這一問題的有效途徑。

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Mutagenic Effects of60Co-γ-rays on Two Species ofGenus Forages

WU BingChao, TONG Lei, DU ZhaoChang, HU JiaLing, ZHANG Huan, CHEN Yi, LIU Wei, ZHANG XinQuan, Huang LinKai

(Department of Grassland Science, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130)

【Objective】 Exploring the mutagenic effects of60Co-γ-rays on×. cv. Reyan No.4 andSchum. cv. Huanan and creating new germplasm, which aims to promote the process ofbreeding. 【Method】 Based on the pre-dose screening, using stems of the two species ofas materials and irradiated by60Co-γ-rays and the dose was 30 Gy, the dose rate was 1 Gy·min-1. Then, the irradiated stems were planted in the field and conventional field cultivation management was performed. The survivor rate was counted one month later. After the plants to be survived mature, we randomly selected 30 individual plants from the two speciesand 7 morphological indicators of them were measured. Then, molecular markers were used to explore the effects of radiation on genetic variation. 【Result】30 individual plants of the two specieswere selected randomly to measure the morphological indicators, respectively. The heights of 28 mutants, internodes of 21 mutants and leaf breadth of 17 mutants of Reyan No.4 have significant differences at 0.05 or 0.01 levels with the control. The heights of 20 mutants of Huanan have significant differences at 0.05 or 0.01 levels with the control, but there were no significant differences in other morphological indicators with the control. Most of the two species ofmutants showed a decrease in plant height, and the biomass also decreased. However, we found that a mutant RY4-17 whose biomass is more than control because it has more tillers. The results of SSR molecular markers indicated that the average PIC of the 20 primers was 0.245 in the Reyan No.4 mutants, and a total of 83 bands were obtained, of which 52 bands were polymorphic. The GS between the mutants and the control was 0.67-0.89, the average was 0.81, the number of different sites was 9-27, with an average of 15.9. The UPGMA cluster showed that the distance between RY4-9, RY4-23 and control was the longest and indicated the mutation degree was greatest. In the Huanan mutants, the average PIC of the 20 primers was 0.394, a total of 81 bands were obtained, of which 65 bands were polymorphic. And the GS between the mutants and the control was 0.54-0.86, the average was 0.77, the number of different sites was 10-38, with an average of 18.8. The UPGMA cluster showed that the distance between HN-24 and control was the longest and indicated the mutation degree was greatest. 【Conclusion】 The appropriate dose of60Co-γ-rays radiation can significantly reduce the survival rate of the two species,and can effectively induce the mutations in the morphological and genetic. The method is an effective way to solve the lack of genetic resources caused by asexual reproduction of.

;60Co-γ-rays; phenotypic variation; genetic variation; SSR molecular markers

10.3864/j.issn.0578-1752.2019.03.003

2018-10-31；

2018-11-22

四川省育種攻關項目（2016NYZ0039）、國家農業產業體系四川飼草創新團隊

武炳超，E-mail：wubingchao94@163.com。通信作者黃琳凱，E-mail：huanglinkai@sicau.edu.cn

（責任編輯 李莉）