冷水魚循環水養殖系統生物濾池成熟過程及 低溫氮降解菌的分離與鑒定?

蔣雯雯， 柳婷婷， 董雙林,2， 田相利,2??， 李 麗,2， 蔡玉勇， 李海東， 趙 坤

(1 .海水養殖教育部重點實驗室(中國海洋大學)，山東 青島 266003; 2 .青島海洋科學與技術國家實驗室，海洋漁業科學與食物產出過程功能實驗室，山東 青島 266235)

循環水養殖是一種通過對系統內養殖廢水進行一系列物理、化學和生物處理，經處理后的水可以被再度用于養殖活動的新型養殖模式。循環水養殖因具有污水排放少、水資源利用率高、可以降低外來疾病引入風險、能夠進行精準的養殖自動化管理等優點，被廣泛應用于水產養殖活動[1]。在循環水養殖系統中，采用生物濾池實現氮元素從高毒害向低毒害的轉換，是水處理的核心技術之一[2]。生物濾池的有效運轉，需要在濾料表面形成生物膜，建立能有效去除氨氮和亞硝酸氮等有害污染物的菌群結構[3]，而養殖活動中的溫度、鹽度、投喂量、水交換量以及日常管理等會直接影響硝化菌群的建立及其硝化效率[4-6]。因此，對于新建成的循環水養殖系統來說，確保生物膜成熟并具有穩定凈化效果是系統早期運行的重點和難點。

受實驗條件的限制，對生物濾池的研究大部分僅限于室內的小規模模擬實驗，少有從商業規模養殖系統中取得研究數據[7-8]，而從商業規模養殖系統中獲得的數據，可以更好得用于系統的優化和設計[9]。另外，多數研究限于20 ℃以上的常溫和高溫系統[3, 10-11]，對于低溫冷水魚循環水養殖系統的研究較少。同時，為維持并提高生物濾池的水處理效率，不少學者嘗試從不同介質上分離得到具有高效降解氨氮和亞硝酸氮功能的細菌[12-13]，然后將這些分離得到的細菌制成微生態制劑添加到生物濾料上，發現可有效提高生物濾料的水處理效率[14]。

本文以新建成的商業規模的冷水魚循環水養殖系統的生物濾池為研究對象，通過測定各類水質指標，探究生物濾池的成熟過程和水處理效果，旨在了解商業規模下低溫循環水養殖系統中生物膜的成熟周期和凈化規律，為今后類似系統生物濾池的管理和設計提供借鑒。同時對成熟生物濾料進行了低溫氮降解細菌的富集和分離，以期獲得可有效降解養殖廢水中氨氮和亞硝酸氮的細菌，用于后續添加至生物濾料上以提高生物膜構建速度和水處理效率。

1 材料與方法

1.1 系統組成及運行

實驗系統位于山東省日照市，主要養殖硬頭鱒(Oncorhynchusmykiss)、虹鱒(Oncorhynchusmykiss)等冷水性魚類，養殖總量為35 000尾，魚規格為40 g，日投喂量按魚體重的1.5%。系統由養殖單元和水處理單元兩部分組成，養殖單元為26個容積16.96 m3的圓形養殖池，總養殖容積440.86 m3，水處理單元包括沉淀池、微濾池、生物濾池、紫外消毒池和曝氣池五部分(見圖1)，其中，生物濾池為6串聯浸沒式結構，總容積587.24 m3，濾料為立體彈性濾料，由聚乙烯纖維絲加工而成，直徑為0.5 mm，比表面積約為360 m2·m-3，形狀類似日常使用的毛刷。生物填料布設完成后，使用魚池養殖廢水對生物濾池浸泡10 d，后開啟循環水養殖系統，系統運行期間日補水量10%，系統的水力停留時間約為1 h，日循環20次。

圖1 循環水養殖系統水處理流程Fig.1 Water treatment process of recirculating aquaculture system

1.2 實驗設計

1.2.2 低溫氮降解細菌的富集和分離 在第90天取生物膜已經成熟的生物填料2 g，以震蕩方式將填料上的生物膜洗脫至100 mL無菌生理鹽水中，制得菌懸液。按照體積比為10∶1的接種量將菌懸液接種到不同的硝化細菌富集培養基中，置于15 ℃，160 r/min的條件下持續培養7 d，記為第一個富集周期，第一個富集周期結束后，將所得的富集菌液按相同方法接種、培養7 d，記為第二個富集周期，如此持續富集7個周期，富集期間取第4、5、6和7富集周期的菌液按照1∶10的接種量，接種至人工配制的降解液中，置于15 ℃，160 r/min的條件下連續測定5天內富集菌液對氨氮和亞硝酸氮的降解效果，實驗設置3個重復。取降解效果好的富集菌液，涂布于相應的富集培養基平板上，置于15 ℃條件下進行培養，待長出單菌落后進行分離、純化。

1.2.3 低溫氮降解細菌的降氮效果測定 將分離、純化得到的細菌于LB液體培養基中培養至OD600值為0.5時，調整菌液濃度為106后按照10%的接種量接種至人工配制的降解液中，置于15 ℃，160 r/min的條件下測定第3和5天各株細菌對氨氮和亞硝酸氮的降解效果，再根據每株細菌的降解效果進一步選取降氮效果好的細菌進行分子生物學鑒定，實驗設置3個重復。

1.3 實驗用富集培養基及降解液

低溫氮降解細菌的富集培養基主要參考李步先的研究[15]，以葡萄糖為碳源，并分別以氨氮和亞硝酸氮為綜合氮源以及氨氮、亞硝氮為單獨氮源，基礎配比如下：

MgSO40.1 g，NaH2PO4·2H2O 0.26 g，K2HPO40.5 g，CaCO31 g， FeSO4·7H2O 0.183 g，葡萄糖0.3或5.0 g(前3個周期所用葡萄糖添加量為0.3 g，后4個周期葡萄糖添加量為5.0 g)，酵母膏0.03 g，1 000 mL純水。

其中，N1富集培養基以添加2 g (NH4)2SO4、0.5 g NH4Cl和 1 g KNO2作為氮源，N2富集培養基以添加2 g (NH4)2SO4和0.5 g NH4Cl作為氮源，N3富集培養基以添加1 g KNO2作為氮源。

人工降解液參考李步先的研究[15]，具體配比如下：

0.2 g NH4Cl，0.2 g NaNO2，2 g葡萄糖，1 000 mL純水。

1.4 水質指標的檢測方法

氨氮、亞硝酸氮、總氮、活性磷和總磷的測定主要參考《養殖水環境化學實驗》[16]，氨氮采用靛酚藍法，亞硝酸氮采用重氮-偶氮比色法，總氮和總磷采用消解法，活性磷采用磷鉬藍法，硝酸氮采用紫外分光光度法；總有機碳、總碳和總無機碳使用德國耶拿公司的總有機碳分析儀(2100S)測定，溫度和溶解氧使用手持溶氧儀AZ8403測定，pH使用筆試酸度計測定，鹽度使用手持式鹽度計測定，OD600值使用酶標儀SYnergy2測定。

1.5 單株細菌對氨氮和亞硝酸氮的降解效率

單株細菌對氨氮和亞硝酸氮降解率(n)計算公式：

n= (C0-Cn)/C0×100%。

式中：n為降解率 (%)；C0為降解液中初始氨氮或亞硝酸氮濃度 (mg/L)；Cn為降解液中氨氮或亞硝酸氮的終濃度 (mg/L)。

1.6 細菌的分子生物學鑒定方法

用水煮法提取細菌的DNA，采用細菌16SrDNA的通用引物27F和1472R進行PCR擴增，擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后送至青島擎科天成生物技術有限公司進行測序。

1.7 數據處理

實驗所得數據使用SPSS 22.0.0.0統計軟件中的ANOVA進行顯著性差異及均值多重比較(Duncan)，以P<0.05為差異顯著水平。

細菌測得的16SrDNA序列與NCBI數據庫進行比對后，下載相似性大于97%的相關細菌序列，使用MEGA 7.0采用鄰接法構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 生物濾池成熟過程中水質變動情況

2.1.1 系統內水質基本情況 在生物膜的培養和成熟過程中，生物濾池和魚池的水溫一直維持在18 ℃左右，pH穩定在7.5～8.0，溶解氧的濃度維持在5 mg/L以上，鹽度均為(見表1)。

表1 系統內水質基本情況Table 1 Fundamental state of the water in the recirculating aquaculture system

注：如無特殊說明，所有表格中數據均為平均值±標準差。

Note: The data in all
Tables were presented as mean ± SD, unless specified.

① Temperature;②Dissolved oxygen ；③Salinity；④Biofilters effluent；⑤Fish pools effluent

2.1.2 系統內氮的變化 實驗過程中，氨氮、亞硝酸氮、硝酸氮和總氮濃度變化見圖2，前20 d內(見圖2(a))，生物濾池出水和魚池出水的氨氮濃度顯著下降 (P< 0.05)，說明生物濾料上附著的硝化細菌數量逐漸增加， 40 d以后，氨氮濃度基本穩定在0.05 mg/L以下。生物濾池出水和魚池出水的亞硝酸氮濃度在前40 d內均呈現先升高再降低的變動特點(見圖2(b))，40 d后系統的亞硝酸氮的濃度也都穩定在0.05 mg/L以下生物濾池出水和魚池出水的硝酸氮和總氮濃度在整個實驗周期內均顯著上升 (P<0.05) (見圖2(c)和2(d))。說明生物濾池中的生物膜主要進行的是將高毒的氨氮轉化為低毒的硝酸氮的硝化反應，對于將硝酸氮轉化為NO或N2排出系統的反硝化作用則很少或沒有發生。綜合比較，40 d后，系統內氨氮和亞硝酸氮的濃度基本保持穩定，說明濾料上的生物膜已經完全成熟。

2.1.3 系統內磷的變化 實驗過程中，生物濾池出水和魚池出水的活性磷與總磷濃度的變化與硝酸氮和總氮的表現相似，均呈現顯著升高的趨勢 (P<0.05) (見圖3(a)和3(b))，說明生物濾池對活性磷和總磷的降解作用不顯著。

2.1.4 系統內碳的變化 實驗前60 d，生物濾池出水和魚池出水的總碳和無機碳濃度呈穩步下降態勢，60 d后趨于穩定(見圖4(c)和4(b))，說明在生物膜成熟過程中也需要利用無機碳作為碳源，但總碳和無機碳在生物濾池出水中濃度的降低相對滯后，說明利用無機碳為碳源的菌群的形成滯后于利用氮、磷的菌群。相應的，與總碳和無機碳相比，從生物布設完成并開始浸泡，生物濾池對有機碳有顯著降解作用(見圖4(a))。實驗第0天，魚池出水中有機碳濃度為13 mg/L，經過生物濾池的降解后，同期內生物濾池出水中的有機碳濃度降低至4 mg/L。實驗10 d后，系統開啟循環運行，由于生物濾池的降解作用，2個測試點水體中的有機碳濃度始終穩定在7 mg/L以下。說明生物濾料上最初形成的群落主要利用有機碳為碳源，并且在以后群落演替的過程中，利用有機碳為碳源的群落也不會消失。

2.2 低溫氮降解富集菌液的降氮效果測定

經過4個周期的富集后(見圖5(a))，不同培養基富集的菌液對氨氮和亞硝酸氮均有較好的降解效果，特別是N3組的富集菌液，經過5天的降解實驗可以將降解液中的氨氮由最初的(36±3.21) mg/L降解至(20±7.13) mg/L (P<0.05)，將亞硝酸氮由最初的(44±0.79) mg/L顯著降解至(2±0.75) mg/L (P<0.05)，說明之前采集到的生物濾料上確實已經形成可以降解氨氮和亞硝酸氮的種群，并且在不斷的富集過程中，這類種群已經逐漸成為優勢種群。經過5個周期的富集后(見圖5(b))，N3組的富集菌液經過5 d的降解實驗可以將降解液中的氨氮由最初的(36±3.21) mg/L降解為(0.9±0.44) mg/L (P<0.05)，將亞硝酸氮由最初的(44±0.79) mg/L降解至(0.076±0.01) mg/L (P< 0.05)；N1和N2組的富集菌液經過5 d的降解實驗可以將亞硝酸氮降解至(0.034±0.01)和(0.046±0.01) mg/L (P<0.05)。經過6個周期的富集后(見圖5c)，N3組的富集菌液在第4天已經能將降解液中的氨氮和亞硝酸氮分別降解至(0.035±0.01)和(0.3±0.17) mg/L (P< 0.05)， N1和N2組的富集菌液也可以在第4天將降解液中的亞硝酸氮顯著降解至(0.25±0.02)和(0.63±0.24) mg/L (P<0.05)。經過7個周期的富集后(見圖5(d))，N3組的富集菌液在第5天能將降解液中的氨氮和亞硝酸氮分別降解至(1.68±0.86)和(0.056±0.01) mg/L (P<0.05)， N1和N2組的富集菌液可以在第4天將降解液中的亞硝酸氮分別降解至(0.25±0.03)和(0.2±0.02)mg/L (P<0.05)。將第7周期各組富集菌液的降解效果與第6周期相比，到第5天，各組在2個周期間沒有顯著差異 (P>0.05)，說明經過6個周期富集的菌液即達到富集要求。

圖2 系統內氨氮(a)、亞硝酸氮(b)、硝酸氮(c)和總氮(d)濃度變化情況Fig.2 Concentration changes of (a), (b), (c), TN (d) in the recirculating aquaculture system

圖3 系統內活性磷(a)和總磷(b)濃度變化情況Fig.3 Concentration changes of (a) and TP (b) in the recirculating system

圖4 系統內有機碳(a)、無機碳(b)和總碳(c)濃度變化情況Fig. 4 Concentration changes of TOC (a), TIC (b) and TC (c) in the recirculating aquaculture system

圖5 不同時期富集菌液對氨氮和亞硝酸氮的降解效果Fig. 5 Degradation effect to ammonia and nitrite among enrichment bacteria of different enriching periods

2.3 低溫氮降解細菌的降氮效果測定

實驗分離得到14株耐低溫的細菌(見表2)，其中有4株細菌 (LB1-4、LB3-J、LB3-1和LB2-6) 經過5 d的降解實驗，可以將降解液中的氨氮由最初的36 mg/L分別降解至1.3、4.7、4.6和5.1 mg/L，降解率達96.39%、86.94%、87.22%和85.83%；有5株細菌 (LB1-4、LB3-J、LB3-1、LB3-3和LB2-6) 經過5 d的降解實驗，可以將降解液中的亞硝酸氮由最初的40 mg/L分別降解至0.22、0.02、0.03、0.03和0.01 mg/L，降解率達99.45%、99.95%、99.93%、99.93%和99.98%。

表2 不同菌株對氨氮和亞硝酸氮的降解效果Table 2 Degradation effect to ammonia and nitrite among different bacteria

注：字體加粗的為氨氮或亞硝酸氮降解效果較好的細菌。

Note: The bold font are the bacteria with better degradation effect of ammonia or nitrite.

2.4 低溫氮降解細菌的鑒定

將分離得到的LB1-4、LB3-J、LB3-1和LB2-6這4株細菌的16S rDNA進行PCR擴增后，將所得序列在NCBI數據庫進行BLAST比對后，選取相似性達97%以上的細菌構建系統發育樹，結果顯示(見圖6)，LB1-4為枯草芽孢桿菌 (Bacillussubtilis)，LB3-J為Velezensis芽孢桿菌 (Bacillusvelezensisstrain SQ-5)，LB3-1為土芽孢桿菌 (Geobacillussp. strain SA2)，LB2-6為短小芽孢桿菌 (Bacilluspumilusstrain AB25A-SW1)。

3 討論

3.1 通過水質變動探究生物濾器成熟過程

生物濾池是循環水養殖系統中的核心單元，主要功能是通過硝化作用將養殖廢水中有毒有害的氨氮和亞硝酸氮轉化為低毒害的硝酸氮。在生物濾池成熟過程中，可以根據生物濾料上生物膜的質量以及氨氮的去除效果劃分為潛伏期、增長期、穩定期和脫落期[3]；也可以根據生物濾料上的細菌數量將其成熟過程劃分為適應期、潛伏期、快速增長期和穩定期[11]。但不管以怎樣的方式對生物濾池的成熟過程進行界定，生物濾池成熟時最顯著的特征為具有穩定的硝化作用，可以達到水質凈化效果[3, 11, 17-18]。本研究中，經過40 d的培養后，生物濾池和養殖魚池出水中的氨氮和亞硝酸氮濃度均基本穩定，因此可以認為本系統經過40 d培養，生物濾池已經達到成熟狀態。在此之前，許多研究指出溫度對硝化細菌的代謝影響顯著，在20 ℃以上水溫條件下，生物濾池成熟一般都需要30～40 d[3, 18]，在25 ℃的條件下，生物濾池有較好的氨氮去除效率[19]。而本次研究結果表明：在較低的水溫條件下 (17～18 ℃)，生物濾池40 d左右成熟，并在低溫下對氨氮、亞硝酸鹽實現有效去除。

圖6 4株低溫氮降解細菌的系統發育進化樹Fig. 6 Phylogenetic trees of 4 bacteria of nitrogen degradation bearing low temperature

生物膜是一個以硝化細菌為主的生物絮團，同時還包括一些藻類、真菌和原生動物[20]。硝化作用主要分為兩個步驟，第一步為氨氮氧化為亞硝酸氮，第二步為亞硝酸氮進一步氧化為硝酸氮[6]。其中，第一步主要由氨氧化細菌和氨氧化古生菌完成[21]，第二步主要由硝化菌屬和硝化螺旋菌屬細菌完成。本研究中，2個測試點的氨氮濃度在系統啟動后表現為持續下降，而亞硝酸鹽濃度則表現為先升后降，硝酸鹽濃度持續上升，說明氨氧化細菌和氨氧化古生菌的生長要優于硝化菌屬和硝化螺旋菌屬細菌的生長，氨氮、亞硝酸鹽和硝酸鹽的變化規律與許多學者的研究結果相似[18, 22]。硝化作用主要是將高毒害的氨氮氧化為低毒的硝酸氮，而硝酸鹽從系統的移除則主要依賴于反硝化反應[23]，可以進行反硝化反應的細菌群落主要為厭氧細菌，較高的溶氧條件會阻礙反硝化菌群的附著和繁殖[24]，在本實驗中硝酸氮濃度和總氮濃度的不斷升高，說明在高溶氧的循環水養殖系統中，生物濾器可以實現高毒氨氮向低毒硝酸氮的轉變，但卻不能實現氮營養鹽的移除。

餌料中磷的溶失是水體中磷含量升高的主要原因[25]。水體中磷的去除，通常需要一個厭氧的條件才能實現[26]。聚磷菌雖是好氧細菌，但其釋磷功能在厭氧條件下才能充分發揮[27]。而本實驗系統溶解氧一直維持在6 mg/L以上，較高的溶氧抑制了聚磷菌釋磷功能的發揮，餌料中磷的不斷溶失，加之生物膜對磷較低的去除效率，最終導致水體中的活性磷和總磷濃度不斷升高，這一現象在其他相關研究中也有發現[25]。

水體中有機碳的濃度可以表征水體中有機物的含量，同時，有機碳源的添加可以改變一些人工基質表面菌群結構的組成，促進異養菌的生長[28]。本研究中，實驗初期生物濾池出水中總有機碳的濃度就出現顯著下降，說明以有機碳為碳源的異養菌形成；20 d以后2個測試點的無機碳才開始出現顯著下降，說明以無機碳為碳源的自養菌形成[29]，因此，推測本系統中最早出現并穩定發揮功能的是異養菌群落，而自養菌群落的出現則相對滯后。

3.2 低溫氮降解細菌富集后的降氮效果

自然條件下具有氮降解功能的細菌數量非常有限，而可被人工分離得到的細菌數量更是僅占全部細菌的1%，因此要得到具有某種特定功能的細菌，需要先進行選擇富集，使具有該功能細菌的數量增長到足夠多時，才有可能將該功能細菌分離出來。當前，針對氮降解細菌的富集，主要通過提供不同的氮源來實現對不同功能氮降解細菌的富集，其中，有的以氨氮為氮源富集可以降解氨氮的亞硝化細菌，有以亞硝酸氮為氮源富集可以降解亞硝酸氮的硝化細菌[30-31]，也有的以添加氨氮為氮源進行硝化細菌的富集[32]。在富集周期上，從7～20天不等，由于硝化細菌生長較慢，所以需要富集幾個周期才可以完成[12-13]。在本研究中，通過對比幾個周期富集菌液的降氮效果，發現對降氮細菌進行周期式的富集會提高富集和降氮效果，但由于生活環境的限制，富集到一定周期后降氮細菌數量會達到頂峰，即使增加富集周期也不會提高富集效果。其中，富集培養基以添加亞硝酸氮為氮源時，富集到的菌液的降氮效果較好。

3.3 低溫氮降解細菌的分離和鑒定

循環水養殖系統中的生物濾料需要形成成熟的生物膜后才能穩定發揮凈水功能。生物濾料掛膜過程中，可通過添加微生態制劑輔助進行掛膜[17]，或接種加入功能穩定的生物濾料以幫助系統加速建立硝化作用[33]，但實際生產中還需要避免引入外來病原微生物，因此最穩妥的方法是對循環水養殖系統生物濾料上自身附著的土著菌進行培養[34]，后期添加至生物濾料上以幫助穩定水處理效果。本實驗通過對前期富集得到的混合菌液進行分離、純化后，最終得到4株對氨氮和亞硝酸氮降解效果好的菌株，這4株細菌對氨氮的降解率可達85%以上，對亞硝酸氮達99%以上，可用于后期添加至生物濾料上，既可以降低引入外來病原微生物的風險，還以幫助提高生物濾料的水處理效率。

4 結語

本研究通過對新建成的商業規模的冷水魚循環水養殖系統的生物濾池的成熟過程進行研究，發現即使在17～18 ℃的低水溫條件下 ，生物濾池經過40 d的培養也可以完成成熟過程。受較高溶氧條件的限制，成熟后的生物濾池只能將養殖水中高毒害的氨氮和亞硝酸氮轉化為低毒害的硝酸氮，而無法通過反硝化作用，將氮和磷從系統中移除。同時，根據水體中有機碳和無機碳的變化，推測生物濾料上自養菌群的產生滯后于異養菌群。采集成熟生物濾料上的生物膜進行富集培養后，發現在15 ℃，160 r/min的條件下，通過添加以亞硝酸氮為氮源的富集培養基，以7 d為1個周期，富集6個周期可以得到降氮效果最好的富集菌液。對富集得到的菌液進行分離、純化和鑒定后，共得到4株可在低溫條件下有效降解氨氮和亞硝酸氮的細菌，分別為枯草芽孢桿菌 (Bacillussubtilis)、Velezensis芽孢桿菌 (Bacillusvelezensisstrain SQ-5)、土芽孢桿菌 (Geobacillussp. strain SA2)和短小芽孢桿菌 (Bacilluspumilusstrain AB25A-SW1)。