銀/稀土元素/碳微球抗菌劑的制備與表征

(中央民族大學 生命與環境科學學院，北京，100081)

隨著社會和經濟的發展，人們日益重視周圍環境安全與抗菌衛生，因此，抗菌材料受到人們廣泛關注。金屬銀和稀土元素對多種致病菌具有強烈的殺滅效果，可以有效抑制并殺滅微生物[1-3]，被廣泛應用于抗菌材料中。抗菌材料的載體有沸石、陶瓷、碳材料等，碳微球(carbon microspheres，CMSs)因其具有良好的化學穩定性、熱穩定性和優良的導電、導熱等特性[4-6]，在諸多領域具有廣闊的應用前景，是一種性能優異的抗菌劑載體，目前已發現多種載銀碳微球抗菌材料。許并社等[6]采用強酸和二氯化錫活化碳微球，之后用還原法制備碳微球負載銀復合材料，利用金屬銀的抗菌活性將其應用于水體凈化中。ZHAO等[7]用真空浸漬法在碳球表面負載銀，并探討其抗菌性能。在制造含銀抗菌劑時，添加含稀土離子的可溶性鹽類能夠進一步提高抗菌劑的抗菌性能[8-10]。本文作者以葡萄糖為碳源，采用水熱法制備碳微球[11]。以此碳微球為載體，采用浸漬還原法[6,12-14]將銀和稀土元素負載到碳微球表面，制得載銀碳微球抗菌劑(Ag/CMSs)和載銀/稀土元素碳微球復合抗菌劑(Ag/Re/CMSs)，并通過抑菌環法[15-16]評價抗菌材料的抗菌性能。

1 實驗

1.1 碳微球(CMSs)的制備

稱取一定量的葡萄糖粉末(3.60，5.76和7.20 g)溶解于40 mL二次蒸餾水中，配制成葡萄糖溶液。超聲20 min使其充分溶解，得到澄清溶液。然后，將所得澄清溶液置于50 mL高壓反應釜中，于180 ℃反應一定時間(4，6和8 h)，冷卻至室溫，得到黑色產物。離心分離后依次用乙醇和水分別對產物進行“超聲—離心—分離”清洗3次。之后將產物置于80 ℃恒溫干燥箱中干燥4 h，即制得CMSs樣品。

1.2 銀/碳微球(Ag/CMSs)的制備

將4 mg碳微球粉末加入到40 mL AgNO3溶液中，其中AgNO3為7.2 mg，混合溶液超聲20 min后于80 ℃溫度下反應 150 min；待反應結束后，自然冷卻至室溫，取出產物，離心分離后依次用乙醇和水分別對產物進行“超聲—離心—分離”清洗3次。之后將產物置于40 ℃恒溫干燥箱中干燥12 h，即制得Ag/CMSs抗菌劑。

1.3 銀/稀土元素/碳微球(Ag/Re/CMSs)的制備

將8 mg碳微球粉末加入到80 mL AgNO3和稀土硝酸鹽的混合溶液中，混合溶液超聲20 min后于80 ℃溫度下反應 150 min；待反應結束后，自然冷卻至室溫，取出產物，離心分離后依次用乙醇和水分別對產物進行“超聲—離心—分離”清洗3次。之后將產物置于40 ℃恒溫干燥箱中干燥12 h，即制得Ag/Re/CMSs抗菌劑，其中，稀土元素(Re)為鑭(La)、鈰(Ce)、鐠(Pr)、釹(Nd)和釤(Sm)。

1.4 結構表征

采用場發射掃描電鏡(JSM-6330F型)、透射電子顯微鏡(GZ-STWIN型)和X線衍射儀(XD-3型)對產物的形貌結構進行表征；選用紅外光譜儀(VERTEX 70型)表征產物表面官能團；通過 X線光電子能譜儀(ESCLABMKII型)分析樣品中元素的價態。

1.5 抗菌性能測試

通過抑菌環法測定所制備材料的抗菌性能。實驗所用菌株為大腸桿菌[CMCC(B)44102]、白葡萄球菌[AS1.3374]和枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501]，購于南京便診生物科技有限公司。

制備抑菌劑樣片：在無菌并干燥的濾紙(直徑d=5 mm)上粘附厚度為1 mm的抗菌劑粉末，備用。

制備陰性對照樣片：在無菌并干燥的濾紙(直徑d=5 mm)上粘附厚度為1 mm的碳微球粉末，備用。

試驗菌的接種：用移液槍將濃度為5×105～5×106CFU/mL的試驗菌懸浮液均勻滴加到營養瓊脂培養基平板表面上，用無菌棉棒在培養基平板表面均勻涂抹3次。每涂抹1次，平板旋轉60°，最后將無菌棉棒繞平板邊緣涂抹1周，蓋好培養皿，于室溫下干燥5 min。

抑菌劑樣片貼放：在培養皿中央放置1個空白試樣作陰性對照，其余抑菌劑樣片置于培養皿外圍。貼放時，用無菌鑷子取樣片貼放于平板表面，各樣片中心之間相距25 mm以上，與平板周緣相距15 mm以上。貼放后，用無菌鑷子輕壓樣片，使其緊貼于平板表面。蓋好平皿，置于37 ℃無菌箱內培養16～18 h觀察結果，測量抑菌環直徑并記錄，從而評價抗菌材料的抗菌性能。據“消毒技術規范”，當抑菌環直徑大于7 mm時，表明材料對該菌種有抗菌活性，且直徑越大，材料對菌種的生長抑制作用越強。

2 結果與討論

2.1 CMSs的紅外光譜分析(IR)

通過紅外光譜對碳微球的表面官能團進行分析，結果如圖1所示。圖1中，波數為3 423 cm-1處的強峰為碳微球表面羥基(—OH)的伸縮振動吸收峰，2 923 cm-1處的峰為 C—H伸縮振動吸收峰，1 707 cm-1處的峰為羰基(C=O)伸縮振動吸收峰，1 621 cm-1處的峰為共扼烯烴的骨架振動吸收峰，1 518 cm-1處的峰為—COO—對稱伸縮振動吸收峰，1 386 cm-1處的峰為苯環骨架振動峰。圖1所示特征峰表明利用水熱法可制備表面含有大量—OH和C=O的碳微球，且碳微球含有苯環結構，表明葡萄糖在水解過程中產生了芳香化。由于CMSs表面帶有大量的—OH及其他活性基團，這些活性基團可與Ag+和Re3+發生還原反應，使Ag+和Re3+被還原從而吸附到CMSs表面。

圖1 碳微球的紅外光譜圖Fig.1 FTIR spectra of carbon microspheres

2.2 Ag/CMSs的X線衍射分析(XRD)

采用X線衍射研究樣品的晶體結構，結果如圖2所示。從圖2 可見：38.05°，44.30°，64.45°和 77.30°處的衍射峰分別對應Ag的(111)，(200)，(220)和(311)晶面，說明單質銀被還原出來并吸附到碳微球表面，且在樣品表面形成的銀為標準面心立方結構，其中(111)面衍射峰最強，表明銀沿(111)方向率先生長[17]。

圖2 Ag/CMSs的X線衍射圖譜Fig.2 XRD pattern of Ag/CMSs

2.3 Ag/La/CMSs的X線光電子能譜分析(XPS)

通過X線光電子能譜來表征抗菌劑樣品中銀元素與稀土元素的存在形式，圖3所示為CMSs，Ag/CMSs和Ag/La/CMSs的XPS圖譜。從圖3可見：CMSs出現了C 1s峰和O 1s峰；而Ag/CMSs抗菌劑的XPS圖譜中除了存在C 1s峰和O 1s峰外，還存在Ag 3d峰，進一步說明了銀被吸附到 CMSs表面；而Ag/La/CMSs的XPS圖譜除了存在C 1s峰、O 1s峰和Ag 3d峰外，還出現了La 3d峰，表明銀與鑭均被吸附到CMSs表面。圖4所示為Ag/CMSs和Ag/La/CMSs中銀的XPS圖譜。由圖4可知：Ag 3d3/2和Ag 3d5/2的結合能分別為374.3 eV和368.3 eV，通過查閱XPS標準數據庫可知，抗菌劑中銀主要以Ag0和Ag2O的形式存在。圖5所示為Ag/La/CMSs中鑭的XPS圖譜，La 3d5/2和La 3d3/2的結合能分別為835 eV和852 eV，通過查閱 XPS標準數據庫可知，抗菌劑中鑭主要以La2O3和La0的形式存在。

圖3 樣品的X線光電子圖譜Fig.3 XPS spectra of samples

圖4 Ag/CMSs和Ag/La/CMSs中Ag的X線光電子圖譜Fig.4 XPS spectra of Ag in Ag/CMSs and Ag/La/CMSs

2.4 掃描電鏡(SEM)和透射電鏡分析(TEM)

圖6(a)所示為CMSs的SEM圖像，可見碳微球粒徑基本均勻，表面相對光滑，分散性良好。圖6(b)所示為Ag/La/CMSs的TEM圖像，其中淺色區域為碳，深色部分為Ag和La，可見Ag和La分散于碳微球上。

圖5 Ag/La/CMSs中La的X線光電子圖譜Fig.5 XPS spectrum of La in Ag/La/CMSs

圖6 CMSs的SEM圖像與Ag/La/CMSs的TEM圖像Fig.6 SEM image of CMSs and TEM image of Ag/La/CMSs

2.5 抗菌實驗分析

2.5.1 Ag/CMSs的抗菌效果評價

實驗選用大腸桿菌、白葡萄球菌和枯草芽孢桿菌作為測試菌種。表1所示為碳微球的合成參數及Ag/CMSs抗菌劑對測試菌種的抑菌環實驗結果。實驗結果表明：Ag/CMSs抗菌劑抗菌效果明顯，其中對枯草芽孢桿菌的生長抑制作用最強，對白葡萄球菌的生長抑制作用最弱；隨著葡萄糖濃度增大和反應時間延長，Ag/CMSs抗菌劑的抗菌效果逐漸減弱。實驗結果表明：當葡萄糖濃度為0.5 mol/L，反應時間為4 h時，Ag/CMSs抗菌劑具有最佳的抗菌效果。

表1 Ag/CMSs對大腸桿菌(E.coli)、白葡萄球菌(S.aureus)和枯草芽孢桿菌(B.subtilis)的抗菌性能Table 1 Antibacterial activity for Ag/CMSs towardE.coli,S.aureusandB.subtilis

2.5.2 Ag/Re/CMSs的抗菌效果評價

表2與圖7所示為Ag/Re/CMSs抗菌劑對測試菌種的抑菌環實驗結果。培養皿中央為CMSs樣片，由圖7可見：在 CMSs周圍均沒有形成抑菌環，表明CMSs本身不具有抗菌性；Ag/Re/CMSs抗菌劑周圍形成了抑菌環，與Ag/CMSs抗菌劑相比，Ag/Re/CMSs抗菌劑對大腸桿菌、白葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的抑制作用顯著增強，其中Ag/Ce/CMSs的抗菌效果最強，對白葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的抑菌環直徑分別為17.0，18.0和18.5 mm，表明Ag/Ce/CMSs抗菌劑對枯草芽孢桿菌的抗菌效果比大腸桿菌與白葡萄球菌的抗菌效果好。

表2 Ag/Re/CMSs對大腸桿菌(E.coli)、白葡萄球菌(S.aureus)和枯草芽孢桿菌(B.Subtilis)的抗菌性能Table 2 Antibacterial activity for Ag/Re/CMSs towardE.coli,S.aureusandB.Subtilis

圖7 Ag/Re/CMSs對大腸桿菌、白葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的抑菌環測試結果Fig.7 Inhibition zone test results ofE.coli,S.aureusandB.Subtilis of Ag/Re/CMSs

3 結論

1) 當葡萄糖濃度為0.5 mol/L，反應時間為4 h時，Ag/CMSs抗菌劑具有最佳的抗菌效果，這可能是由于在該條件下碳微球的粒徑較小且粒徑較均一，球形度較高。

2) 銀以Ag0和Ag2O的形式被吸附到CMSs表面，稀土元素以稀土氧化物和單質的形式被吸附到 CMSs表面。

3) CMSs本身對大腸桿菌、白葡萄球菌和枯草芽孢桿菌不具有抗菌性，而銀與稀土元素具有抗菌效果，稀土元素對銀的抗菌效果會產生協同作用，可以提高抗菌劑的抗菌性能，因此，Ag/CMSs與Ag/Re/CMSs抗菌劑對上述菌種有良好的抗菌效果，且Ag/Re/CMSs的抗菌效果明顯增強，其中，Ag/Ce/CMSs抗菌效果最佳。