二甲雙胍對HaCaT細胞增殖分化和炎癥因子分泌的影響

宋翠豪 王睿 陳雙景 鄭力強 趙梓綱 楊京潤 李承新

1解放軍總醫院皮膚科，北京 100853；2軍事科學院軍事醫學研究院輻射醫學研究所放射生物學研究室，北京 100850

二甲雙胍作為一種胰島素增敏劑，廣泛應用于2型糖尿病的治療。近年來的研究表明，二甲雙胍能抑制乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌等多種腫瘤細胞的生長，其機制可能與抑制腫瘤細胞的過度增殖和促進細胞凋亡有關［1-2］。銀屑病和惡性腫瘤都具有特征性的細胞過度增殖。角質形成細胞的過度增殖、分化不全、炎性細胞的浸潤是銀屑病的重要特征［3］。本文主要研究二甲雙胍對角質形成細胞增殖、分化、炎癥因子分泌等的影響，并探討其機制，為二甲雙胍應用于銀屑病的治療提供依據。

材料與方法

一、細胞來源及主要試劑

HaCaT細胞系（上海復祥生物科技有限公司）。二甲雙胍（美國Sigma公司），Dulbecco改良Eagle高糖培養基（DMEM，美國Gibco公司），胎牛血清（美國Excel公司），膜聯蛋白（Annexin）Ⅴ-FITC/碘化丙錠（PI）凋亡試劑盒（北京嘉美生物技術公司），細胞周期檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；人白細胞介素8（IL-8）酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測試劑盒、人腫瘤壞死因子α（TNF-α）ELISA檢測試劑盒、人白細胞介素23（IL-23）ELISA檢測試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；鼠抗人GAPDH單克隆抗體（天津三箭生物技術有限公司）；兔抗人角蛋白1多克隆抗體、兔抗人內披蛋白單克隆抗體、兔抗人角蛋白16單克隆抗體、兔抗人Bcl-2單克隆抗體（美國Abcam公司）；兔抗人角蛋白17單克隆抗體、兔抗人信號傳導和轉錄活化因子3（STAT3）分子單克隆抗體、兔抗人蛋白激酶B（AKT）分子單克隆抗體、兔抗人哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）分子單克隆抗體、兔抗人Bax單克隆抗體、兔抗人磷酸化信號傳導和轉錄活化因子3（p-STAT3）分子單克隆抗體、兔抗人磷酸化蛋白激酶B（p-AKT）分子單克隆抗體、兔抗人磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（p-mTOR）分子單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔二抗、辣根過氧化物酶標記山羊抗鼠二抗（美國CST公司）；BCA蛋白定量試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司），CCK8試劑盒（日本同仁化學試劑公司）。

二、方法

1.細胞培養及形態學觀察：采用含10%胎牛血清、1%青霉素及鏈霉素的DMEM培養基培養HaCaT細胞，置于37℃、5%CO2培養箱中。二甲雙胍以磷酸鹽緩沖液（PBS）配置成1 mol/L儲存液，于-20℃保存。含10%胎牛血清、1%青霉素及鏈霉素的DMEM培養基分別將二甲雙胍稀釋至0.5、1、2、5、10、20、25、50、100 mmol/L。細胞以1×106個/ml接種于6孔板，待細胞生長至6孔板底70%時，加入0、25、50、100 mmol/L二甲雙胍培養液培養48 h，倒置顯微鏡下觀察細胞形態。

2.CCK8法檢測HaCaT細胞存活率：細胞以1×103個/ml接種于96孔板，分別加入含1、2、5、10、20、50 mmol/L二甲雙胍培養液，同時設對照組（不加二甲雙胍，僅加入含10%胎牛血清、1%青霉素及鏈霉素的DMEM培養基），空白組（不加二甲雙胍及細胞，僅加入含10%胎牛血清、1%青霉素及鏈霉素的DMEM培養基），每孔設5個復孔。分別培養至24、48、72 h后，每孔加入CCK8試劑10μl，于培養箱中孵育2 h。酶標儀測定450 nm波長處各孔吸光度（A值），實驗重復3次，取均值。細胞存活率（%）=（實驗孔A值-空白孔A值）/（對照孔A值-空白孔A值）×100%。

3.流式細胞儀檢測：分別加入0、0.5、1、2、5、10 mmol/L二甲雙胍工作液培養HaCaT細胞48 h，收集細胞，①細胞周期檢測：加入含10%胎牛血清的PBS溶液300μl，將細胞沉淀制成單細胞懸液后，加700μl無水乙醇，-20℃固定24 h，離心，PBS洗滌細胞，染色，上機檢測各組細胞周期分布；②細胞凋亡檢測：加入1×結合緩沖液300μl懸浮細胞，再加入Annexin V-FITC 5μl混勻，避光，室溫孵育15 min，上機前5 min加入PI染液5μl，分析各組細胞凋亡率。

4.ELISA檢測細胞培養上清液中IL-8、TNF-α、IL-23含量：分別加入0、0.5、1、2、5、10 mmol/L二甲雙胍工作液培養HaCaT細胞48 h后，收集細胞上清液，按ELISA試劑盒說明檢測細胞培養上清液中IL-8、TNF-α、IL-23蛋白含量。

5.Western印跡法檢測細胞增殖分化和凋亡相關蛋白的表達：分別加入0、0.5、1、2、5、10 mmol/L二甲雙胍工作液培養HaCaT細胞48 h后，收集細胞，加入含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的裂解液提取總蛋白，用BCA法檢測蛋白濃度，上樣量為30μg，電泳，轉膜，封閉，孵育一抗，置于4℃冰箱過夜。洗膜，孵育二抗，洗膜，顯影。采用ImageJ 6.0圖像分析軟件分析條帶灰度值，細胞增殖分化相關蛋白角蛋白16、角蛋白17、角蛋白1、內披蛋白和細胞凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2、AKT、mTOR、STAT3、p-AKT、p-mTOR、p-STAT3的目的蛋白條帶與相應的內參照GAPDH條帶的灰度值比值作為其蛋白表達的半定量指標。

6.統計學分析：采用SPSS19.0軟件，計量資料以±s表示，不同濃度組間觀察指標的變化采用單因素方差分析，不同時間和濃度組間比較采用重復測量的方差分析，兩兩多重比較采用LSD-t檢驗，檢驗水準α=0.05。

結 果

一、常規細胞形態學改變和細胞活力分析

正常培養的HaCaT細胞生長至48 h時，形態規則，大小均勻，透亮度好，邊界清楚，細胞之間排列較為緊密。而25、50、100 mol/L二甲雙胍干預培養HaCaT細胞48 h時，細胞形態變得不規則，細胞間連接不緊密，細胞數量減少，培養液中細胞碎片增多，且隨藥物濃度增加細胞形態改變更加明顯。見圖1。

圖1 倒置顯微鏡下觀察不同濃度二甲雙胍干預48 h對HaCaT細胞形態的影響（圖中標尺=50μm）二甲雙胍干預后，細胞形態變得不規則，細胞間粘附性變差，連接不緊密，細胞數量減少，培養液中細胞碎片增多，細胞形態改變隨藥物濃度增加更加明顯

CCK8實驗結果顯示，二甲雙胍對HaCaT細胞增殖有抑制作用。重復測量的方差分析顯示，1、2、5、10、20、50 mmol/L二甲雙胍對HaCaT細胞存活率均有抑制作用（F濃度=116.87，P＜0.05），濃度越高，抑制作用越強；各組HaCaT細胞存活率有隨時間變化的趨勢（F時間=9.01，P＜0.05），48和72 h細胞存活率均低于24 h（P＜0.05），而48與72 h差異無統計學意義（P＞0.05）；藥物濃度與時間有交互作用（F=8.12，P＜0.05），各組HaCaT細胞存活率隨時間變化的趨勢不同。見圖2。

圖2 不同濃度二甲雙胍對HaCaT細胞存活率的影響隨著二甲雙胍濃度增加，細胞存活率逐漸降低

二、流式細胞儀檢測二甲雙胍干預后細胞周期的變化

0、0.5、1、2、5、10 mmol/L二甲雙胍干預HaCaT細胞48 h后，G2/M期比例分別為（5.55±1.03）%、（6.37±0.93）%、（8.57±1.18）%、（10.05±0.60）%、（10.76±0.87）%、（13.63±1.41）%，組間差異有統計學意義（F=24.98，P＜0.05）；兩兩多重比較顯示，1、2、5、10 mmol/L二甲雙胍組G2/M期比例均顯著高于對照組（均P＜0.05）；0.5 mmol/L組與對照組、1與2 mmol/L組、2與5 mmol/L組間差異均無統計學意義，余各濃度組間差異均有統計學意義（P＜0.05）。見圖3。

圖3 不同濃度二甲雙胍干預HaCaT細胞48 h對其細胞周期的影響隨著二甲雙胍濃度增加，G2/M期細胞比例升高

0、0.5、1、2、5、10 mmol/L二甲雙胍組早期細胞凋亡率分別為（0.78±0.71）%、（19.18±1.41）%、（25.67±1.34）%、（28.45±0.92）%、（34.97±2.12）%、（40.41±1.49）%，組間差異有統計學意義（F=296.08，P＜0.05）。兩兩多重比較顯示，各濃度組細胞早期凋亡率均顯著高于對照組（均P＜0.05），各濃度組間差異亦均有統計學意義（均P＜0.05）。見圖4。

圖4 不同濃度二甲雙胍干預48 h對HaCaT細胞凋亡的影響隨著二甲雙胍濃度增加，早期細胞凋亡率升高

三、二甲雙胍對HaCaT細胞內披蛋白、角蛋白1、角蛋白16、角蛋白17、Bax、Bcl-2蛋白表達的影響

Western印跡顯示，二甲雙胍干預HaCaT細胞48 h后，隨二甲雙胍濃度的增加，角蛋白1、Bax蛋白表達呈上升趨勢（均P＜0.05），角蛋白16、角蛋白17、Bcl-2蛋白表達呈下降趨勢（均P＜0.05），但內披蛋白的表達差異無統計學意義（P＞0.05）。與對照組相比，2、5、10 mmol/L組角蛋白1、Bax蛋白表達明顯增加，角蛋白16、Bcl-2蛋白表達明顯降低（均P＜0.05）。5、10 mmol/L組角蛋白16表達顯著低于2 mmol組（P＜0.05）。隨二甲雙胍濃度增加，角蛋白17表達也呈一定的下降趨勢，但僅10 mmol/L組顯著低于對照組（P＜0.05），其余各組與對照組相比差異均無統計學意義（P＞0.05）。見圖5、表1。

圖5 不同濃度二甲雙胍干預HaCaT細胞48 h對內披蛋白、角蛋白1、角蛋白16、角蛋白17、Bax、Bcl-2蛋白表達的影響1：對照組；2～6：分別為0.5、1、2、5、10 mmol/L二甲雙胍組。隨二甲雙胍濃度增加，角蛋白1、Bax蛋白表達逐漸增加，角蛋白16、角蛋白17、Bcl-2蛋白表達逐漸降低，但各組內披蛋白的表達無明顯差異

表1 二甲雙胍作用HaCaT細胞48 h內披蛋白、角蛋白1、角蛋白16、角蛋白17、Bax、Bcl-2蛋白表達水平（與GAPDH條帶灰度值的比值）比較（±s）

表1 二甲雙胍作用HaCaT細胞48 h內披蛋白、角蛋白1、角蛋白16、角蛋白17、Bax、Bcl-2蛋白表達水平（與GAPDH條帶灰度值的比值）比較（±s）

注：n=3。a與2 mmol/L組相比，P＜0.05；b與5 mmol/L組相比，P＜0.05；c與對照組比，P＜0.05；d與0.5 mmol/L組相比，P＜0.05；e與1 mmol/L組相比，P＜0.05

二甲雙胍濃度0（對照組）0.5 mmol/L 1 mmol/L 2 mmol/L 5 mmol/L 10 mmol/L F值P值內披蛋白0.82±0.25 0.71±0.17 0.71±0.27 0.61±0.14 0.55±0.01 0.61±0.09 0.57 0.72角蛋白1 0.09±0.08a b 0.30±0.12a b 0.44±0.18b 0.73±0.27c d 0.87±0.32c d e 0.97±0.12c d e 8.86＜0.01角蛋白16 1.16±0.08a b 0.99±0.33b 0.97±0.08b 0.80±0.14c 0.63±0.18a c d e 0.51±0.06a c d e 8.02＜0.01角蛋白17 0.61±0.17 0.57±0.14 0.63±0.15 0.60±0.14 0.55±0.13d 0.16±0.12a b c d e 4.82 0.01 Bax 0.18±0.05a b 0.19±0.04a b 0.38±0.11 0.47±0.15c d 0.58±0.16c d 0.57±0.08c d 5.38 0.03 Bcl-2 0.67±0.14a b 0.56±0.07a b 0.56±0.06a 0.31±0.03c d e 0.16±0.14c d e 0.11±0.18c d e 12.10＜0.01

四、二甲雙胍對HaCaT細胞炎癥因子分泌影響

與對照組相比，不同濃度二甲雙胍干預HaCaT細胞48 h能顯著降低IL-8、TNF-α的分泌（F=33.89、14.99，均P＜0.05），但對IL-23的抑制作用不明顯，差異無統計學意義（F=2.12，P＞0.05）。

兩兩多重比較顯示，除0.5 mmol/L二甲雙胍組，各濃度二甲雙胍組IL-8表達水平均顯著低于對照組（均P＜0.05），1與2 mmol/L組間差異無統計學意義（P＞0.05），余各濃度組間差異均有統計學意義（P＜0.05）。

與對照組相比，各濃度組TNF-α表達水平明顯下降（均P＜0.05），但各濃度組間差異無統計學意義（均P＞0.05）。見圖6。

圖6 不同濃度二甲雙胍干預48 h后對HaCaT細胞分泌白細胞介素8（IL-8）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、IL-23水平的影響a：P＜0.05；b：P＞0.05

五、二甲雙胍抑制HaCaT細胞AKT、mTOR、STAT3蛋白磷酸化

Western印跡顯示，二甲雙胍干預HaCaT細胞48 h后，與對照組相比，隨二甲雙胍濃度增加，p-AKT、p-mTOR、p-STAT3表達水平呈下降趨勢（F=11.38、0.35、4.38，均P＜0.05），而各濃度組間AKT、mTOR、STAT3蛋白表達差異無統計學意義（F=0.66、0.35、4.24，均P＞0.05）。兩兩多重比較顯示，2、5、10 mmol/L二甲雙胍組p-AKT、p-mTOR、p-STAT3表達水平明顯低于對照組（均P＜0.05），而2、5、10 mmol/L各組間差異無統計學意義（均P＞0.05）。0.5、1 mmol/L組與對照組間p-AKT、pmTOR、p-STAT3表達水平差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2、圖7。

表2 二甲雙胍作用HaCaT細胞48 h后p-AKT、AKT、p-STAT3、STAT3、p-mTOR、mTOR蛋白相對表達水平（±s）

表2 二甲雙胍作用HaCaT細胞48 h后p-AKT、AKT、p-STAT3、STAT3、p-mTOR、mTOR蛋白相對表達水平（±s）

注：n=3。a與2 mmol/L組相比，P＜0.05；b與5 mmol/L組相比，P＜0.05；c與對照組相比，P＜0.05；d與0.5 mmol/L組相比，P＜0.05；e與1 mmol/L組相比，P＜0.05

二甲雙胍濃度0（對照組）0.5 mmol/L 1 mmol/L 2 mmol/L 5 mmol/L 10 mmol/L F值P值p-AKT 1.04±0.28a b 0.91±0.16a b 0.79±0.12a b 0.46±0.03c d e 0.43±0.02c d e 0.41±0.03c d e 11.38＜0.01 AKT 1.11±0.14 0.97±0.23 0.77±0.01 0.70±0.09 0.87±0.47 1.00±0.37 0.66 0.67 p-STAT3 0.82±0.14a b 0.74±0.02a b 0.63±0.03 0.45±0.05c d 0.39±0.04c d 0.24±0.22c d e 8.41 0.01 STAT3 1.12±0.16 1.03±0.01 0.91±0.08 0.87±0.01 0.81±0.06 0.87±0.07 4.24 0.05 p-mTOR 1.61±0.24a b 1.58±0.20a b 1.29±0.34 1.09±0.29c d 0.99±0.12c d 0.98±0.14c d 4.38 0.02 mTOR 0.96±0.20 0.87±0.05 0.82±0.08 0.84±0.11 0.81±0.14 0.81±0.18 0.35 0.86

圖7 不同濃度二甲雙胍干預48 h后對HaCaT細胞p-AKT、AKT、p-STAT3、STAT3、p-mTOR、mTOR蛋白的影響1：對照組；2～6：分別為0.5、1、2、5、10 mmol/L二甲雙胍組；隨二甲雙胍濃度增加，p-AKT、p-mTOR、p-STAT3蛋白表達逐漸降低

討 論

近年來，有關二甲雙胍對銀屑病治療作用的研究日益增多。Brauchli等［4］調查了英國36 702例銀屑病患者及Wu等［5］對中國臺灣地區1 165 972例糖尿病患者使用抗糖尿病藥物與患銀屑病風險的研究均發現，長期服用二甲雙胍的糖尿病患者發生銀屑病的風險降低。Singh和Bhansali［6］將83例伴代謝綜合征的銀屑病患者在局部外用藥治療的基礎上隨機分為安慰劑組，吡格列酮和二甲雙胍治療組，12周后，服用二甲雙胍和吡格列酮的患者銀屑病面積和嚴重程度指數（PASI）、紅斑、鱗屑、浸潤評分（ESI）、醫師綜合評價（PGA）評分均有顯著改善。

角蛋白16、17是角質形成細胞增殖的標志，角蛋白1、內披蛋白是角質形成細胞分化的標志。角蛋白16、17在正常皮膚中不表達或少量表達，但在銀屑病活動早期皮損處高表達［7-8］。角質形成細胞分化的第一步是角蛋白1和10的異源二聚體形成細胞骨架絲，銀屑病皮損中細胞分化不良，角蛋白1的表達減少［8-9］。內披蛋白是交聯包膜的蛋白前體，為細胞終末分化的標記，銀屑病患者的表皮中內披蛋白表達量明顯增加［10］。Liu等［11］發現，二甲雙胍能抑制體外培養的HaCaT細胞增殖和凋亡。江萌等報道［12］，二甲雙胍能顯著抑制HaCaT細胞的增殖，其抑制率呈明顯的濃度依賴性。我們研究發現，二甲雙胍對HaCaT細胞增殖有抑制作用，且隨著二甲雙胍濃度的增加，細胞存活率逐漸降低，二甲雙胍還能阻滯細胞在G2/M期，并促進細胞凋亡。我們還發現，二甲雙胍可抑制角蛋白16、17的表達，促進角蛋白1的表達，促進促凋亡蛋白Bax的表達，并抑制凋亡蛋白Bcl-2的表達，提示二甲雙胍可以抑制角質形成細胞增殖，促進其分化。但二甲雙胍對終末分化標記內披蛋白的表達無明顯影響，我們推測二甲雙胍可能對角質形成細胞分化的不同階段有不同影響。本研究提示，二甲雙胍可能對角質形成細胞分化早期具有部分調控作用，但其具體機制有待進一步探討。

IL-8、TNF-α是重要的促炎細胞因子，IL-8具有趨化白細胞、直接刺激角質形成細胞的增生、促進病變皮膚組織中大量微血管形成等作用，TNF-α可以誘導角質形成細胞表達細胞間黏附分子1，促進角質形成細胞增生、炎癥細胞的黏附，還可刺激角質形成細胞分泌IL-8。二者可能相互誘導或協同參與銀屑病的炎癥性免疫病理過程［13］。有研究發現［11］，二甲雙胍能抑制體外培養的HaCaT細胞炎癥因子IL-6、TNF-α和血管內皮生長因子的表達水平。我們發現，二甲雙胍可以抑制HaCaT細胞分泌IL-8、TNF-α，進一步證明了二甲雙胍的抗炎作用。近年研究表明［14］，角質形成細胞也可表達IL-23的兩個亞單位p19和p40，過表達IL-23可能對銀屑病的炎性過程起一定作用。但IL-23在銀屑病病理生理過程及其與銀屑病先天性和獲得性免疫系統中其他相關細胞和分子通路之間的相互作用等還有待進一步研究。我們的研究未發現二甲雙胍對IL-23的抑制作用，提示二甲雙胍是對部分炎癥因子具有抑制作用，具體機制尚不明確。

除了角質形成細胞的過度增殖，角質形成細胞分化不全也是銀屑病的重要特征。目前，尚無二甲雙胍對角質形成細胞分化影響的相關報道。我們研究發現，二甲雙胍可以誘導分化相關蛋白角蛋白1的表達，并能抑制AKT、mTOR、STAT3蛋白的磷酸化，推測二甲雙胍對角質形成細胞作用的機制可能與AKT/mTOR/STAT3信號通路有關。活化的AKT、mTOR、STAT3可參與促進細胞生長和增殖、抑制細胞凋亡、調節細胞代謝等多種細胞功能和效應的調節。相關研究表明［15-16］，銀屑病皮損中AKT、mTOR、STAT3表達顯著高于正常皮膚組織，提示該通路的表達增加和活化在銀屑病發病機制中可能起重要作用。本研究發現，二甲雙胍可以抑制AKT、mTOR、STAT3的 磷 酸 化，但 對AKT、mTOR、STAT3蛋白表達無影響，推測二甲雙胍可以通過抑制AKT、mTOR、STAT3的磷酸化調控角質形成細胞的增殖、凋亡、分化及炎癥因子分泌。

本研究顯示，二甲雙胍可以抑制HaCaT細胞的增殖，使細胞發生G2/M期阻滯并誘導細胞凋亡，促進角質形成細胞分化，抑制炎癥因子分泌，其機制可能與抑制AKT/mTOR/STAT3信號通路有關。但本研究仍缺乏二甲雙胍對細胞增殖、凋亡、分化等相關分子機制的深入研究，二甲雙胍是否主要通過AKT/mTOR/STAT3信號通路作用于HaCaT細胞，除此通路外是否還有其他機制參與其中有待進一步研究。同時本研究結果只能初步為二甲雙胍治療銀屑病提供部分實驗和理論依據，但其是否能成為該病治療的一種新型藥物尚需進一步研究。