BP180抗體在大皰性類天皰瘡及神經(jīng)系統(tǒng)疾病患者血清中的表達(dá)

朱磊 李博平 巫毅吉林省人民醫(yī)院皮膚科，長(zhǎng)春 30000；吉林大學(xué)第二醫(yī)院皮膚科，長(zhǎng)春 3004

大皰性類天皰瘡（bullous pemphigoid，BP）的發(fā)病機(jī)制尚不明確。近年國(guó)內(nèi)外研究證明，該病與神經(jīng)系統(tǒng)疾病（neurologiealdisease，ND）關(guān)系密切。李麗等［1］應(yīng)用免疫印跡法證實(shí)，BP患者血清中存在能夠識(shí)別腦組織抗原的抗體，該抗體可能在BP合并ND的發(fā)生機(jī)制中具有一定作用。有學(xué)者認(rèn)為BP180同樣存在皮膚亞型及神經(jīng)亞型［2-3］。我們旨在通過(guò)檢測(cè)BP患者及ND患者血清BP180，分析BP180是否存在皮膚亞型、神經(jīng)亞型，二者是否具有同源性，從而進(jìn)一步探討B(tài)P發(fā)病機(jī)制及其與ND之間的關(guān)系。

一、研究對(duì)象

收集2012年1月至2013年9月吉林大學(xué)第二醫(yī)院皮膚科門診及住院BP患者和神經(jīng)科初診ND患者臨床資料。BP患者均經(jīng)臨床及病理確診，為首次發(fā)病，入院前未經(jīng)治療。ND患者為同期我院神經(jīng)內(nèi)科住院患者，NS系統(tǒng)損害診斷符合神經(jīng)內(nèi)科診斷標(biāo)準(zhǔn)［4］。本研究嚴(yán)格遵守《赫爾辛基宣言》，充分考慮了受試者的健康與利益。

將研究對(duì)象分為4組，BP組20例，為既往無(wú)ND的BP患者，發(fā)病年齡43～86（68.6±8.6）歲，其中男12例、女8例，病程≤15 d；BP+ND組20例，為伴有ND病史的BP患者，BP發(fā)病年齡46～83（70.2±7.7）歲，其中男13例、女7例，ND病史6～40個(gè)月，平均14個(gè)月，BP病程≤17 d；ND組20例，為僅有ND的患者，發(fā)病年齡47～78（68.5±5.8）歲，其中男11例、女9例，病程≤10 d，包括腦梗塞11例、腦出血8例、癲癇1例；健康對(duì)照組20例，為我院健康體檢志愿者，并排除BP及ND，年齡45～78（70.4±6.6）歲，其中男女各10例。各組間年齡和性別分布比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

二、實(shí)驗(yàn)方法

入院當(dāng)天或第2天采取靜脈血2 ml，常溫下放置2 h，以2 500 r/min（離心半徑5 cm）離心10 min后，分離血清，置-70℃超低溫冰箱凍存。采用BP180抗體檢測(cè)試劑盒（北京博爾邁生物技術(shù)有限公司），應(yīng)用ELISA法測(cè)定各組血清BP180抗體滴度。根據(jù)樣本A450值判定結(jié)果。目前BP180抗體尚無(wú)國(guó)際通行的參考標(biāo)準(zhǔn)，因此本檢測(cè)結(jié)果校準(zhǔn)時(shí)采用相對(duì)單位。相對(duì)單位≥9為陽(yáng)性，＜9為陰性。同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性和陰性標(biāo)準(zhǔn)血清對(duì)照，陰性標(biāo)準(zhǔn)血清的A450必須≤0.100，陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)血清≥0.500，如不符合上述標(biāo)準(zhǔn)，視為無(wú)效，必須重新檢測(cè)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)以±s表示，各組間性別分布比較采用卡方檢驗(yàn)；各組年齡、BP180抗體滴度均采用非參數(shù)檢驗(yàn)Kolmogorov-Smirnov方法進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，結(jié)果顯示各組數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布，因此多組間均數(shù)比較采用方差分析，兩兩比較采用Games-Howell檢驗(yàn)，P＜0.05表示組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

四、結(jié)果

健康對(duì)照組20例BP180抗體均陰性，滴度為0.790±0.851；BP組20例均為陽(yáng)性，滴度為128.347±54.678；BP+ND組20例均為陽(yáng)性，滴度為143.482±72.568；ND組20例中，7例陽(yáng)性，包括腦出血4例、腦梗塞3例，其中BP180抗體最高滴度（39.638）出現(xiàn)在1例腦梗塞患者。

4組間BP180抗體滴度比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=55.624，P＜0.05）；BP組與BP+ND組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.878）；BP組與ND組、BP組與健康對(duì)照組、BP+ND組與ND組、BP+ND組與健康對(duì)照組、ND組與健康對(duì)照組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 Games-Howell檢驗(yàn)比較各組間BP180抗體滴度

五、討論

BP發(fā)病是由致病性自身抗體介導(dǎo)、補(bǔ)體及多細(xì)胞因子參與激活皮膚免疫損傷的一個(gè)復(fù)雜過(guò)程。目前已經(jīng)明確致病性自身抗體在其發(fā)病中起關(guān)鍵作用，但對(duì)自身抗體的產(chǎn)生機(jī)制尚有待深入了解［5］。BP主要有兩種抗原，即BPAG1（Bp230，dystonin）、BP180（Bp180，ⅩⅦ型膠原）。BPAG l相對(duì)分子質(zhì)量為230 000，是半橋粒胞質(zhì)內(nèi)蛋白，主要作用是介導(dǎo)角蛋白中間細(xì)絲和致密斑之間的相互連接。BP180在人腦中主要位于胞質(zhì)，且不同區(qū)域的分布密度也不相同，如在運(yùn)動(dòng)核團(tuán)（舌下神經(jīng)核、動(dòng)眼神經(jīng)核）、海馬CA2-CA4區(qū)椎體細(xì)胞、Betz細(xì)胞、基底前腦核團(tuán)（Meynert核、視上核）、丘腦底核多見，但在白質(zhì)、膠質(zhì)細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)則沒有表達(dá)。在皮膚中主要位于胞膜，在其胞外區(qū)存在一帶有柔性尾部的桿狀蛋白結(jié)構(gòu)，憑此結(jié)構(gòu)，可使BP180對(duì)維持半橋粒復(fù)合體的完整性、以及表皮與真皮的正常黏附發(fā)揮作用。致病性抗體就是通過(guò)與基底膜帶透明層部位該抗原結(jié)合，發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，在補(bǔ)體等因素參與下，直接與皮膚基底膜的半橋粒蛋白BP180胞外區(qū)域的膜近端非膠原16A區(qū)域（BP180 NCl6A）結(jié)合，激活補(bǔ)體，趨化炎癥細(xì)胞到達(dá)炎癥部位，釋放蛋白水解酶，從而引起水皰和大皰［2-3］。BP180作為BP致病性抗體識(shí)別的主要靶抗原，對(duì)其自身抗體的檢測(cè)不僅可以為BP診斷提供證據(jù)，甚至可用來(lái)評(píng)價(jià)疾病嚴(yán)重程度、判斷療效［6］。回顧國(guó)內(nèi)外病例研究證明，BP患者常合并ND，主要包括腦血管疾病（腦梗塞、腦出血）、癲癇、血管性癡呆、阿爾茨海默病、帕金森病、原發(fā)性震顫、偏癱等。

以往研究提示，BPAG1、BP180可能都存在皮膚亞型及神經(jīng)亞型，BPAG1有皮膚亞型（BPAG1-e，主要存在于表皮）和神經(jīng)亞型（BPAG1-a和BPAG1-n，主要存在于神經(jīng)系統(tǒng)），它們之間存在一定同源性，但致病表位不同；2006年證實(shí)BP180在人腦神經(jīng)元表達(dá)［7］，但未做具體分型。Foureur等［8］通過(guò)研究證實(shí)，BP180在人腦神經(jīng)元有表達(dá)。Zhu等［9］認(rèn)為BP180的分子量大小為160 000～180 000。李麗等［1］以小鼠腦組織提取物為底物行免疫印跡實(shí)驗(yàn)進(jìn)行初步探討，結(jié)果有病例分別檢測(cè)到165 000條帶、180 000條帶，可認(rèn)為是BP180。所以，ND患者發(fā)生BP可能是由于神經(jīng)系統(tǒng)病變后，BPAG的神經(jīng)亞型暴露，與BPAG神經(jīng)亞型自身抗體結(jié)合，再通過(guò)免疫交叉反應(yīng)與皮膚亞型BPAG反應(yīng)，在補(bǔ)體、其他細(xì)胞因子共同作用下，誘導(dǎo)BP發(fā)生。

李麗等［1］通過(guò)免疫印跡發(fā)現(xiàn)，通過(guò)以腦組織為底物進(jìn)行檢測(cè)，BP患者與BP+ND患者相對(duì)分子質(zhì)量為165 000、180 000的抗原的出現(xiàn)率均存在差異。本實(shí)驗(yàn)中BP組和BP+ND組BP180抗體檢測(cè)結(jié)果未見差異，可能與未進(jìn)行相對(duì)分子質(zhì)量區(qū)分，或相對(duì)分子質(zhì)量為165 000的蛋白在ND組中表達(dá)水平較低有關(guān)。李麗等［1］也提出，在BP合并ND的病例中，一般為ND在先，BP發(fā)生在后，二者間隔數(shù)月至數(shù)年。本文ND組中，部分患者出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果，但未合并BP，是否由于這些患者處于ND早期而未發(fā)病？本研究中ND組BP180陽(yáng)性，但其數(shù)值均較低，因此，我們猜測(cè)，ND組中BP180抗體可能總量較小，不足以激活補(bǔ)體和其他細(xì)胞因子發(fā)生免疫反應(yīng)，或免疫反應(yīng)作用輕微，尚不能誘導(dǎo)BP發(fā)病。因此，臨床觀察中若發(fā)現(xiàn)ND患者BP180抗體異常增高，應(yīng)定期隨訪監(jiān)測(cè)，及早預(yù)見BP發(fā)生。