CD47抗體對低氧/復氧大鼠心肌細胞的保護作用

黃 偉，王邦寧，趙 韌，朱繼田，李 倩，侯道榮

心肌缺血再灌注(ischemia/reperfusion, I/R)損傷是臨床上心臟內科和心臟外科常見的病理生理現象，比如急性心肌梗死患者接受溶栓或介入治療及血運重建均會造成I/R損傷[1-2]。心肌缺血再灌注損傷是缺血的心肌恢復血液供應后心肌細胞在形態、功能、代謝和電生理學表現等方面發生一系列的損傷表現[3]。這種損傷會激活細胞凋亡和自噬，導致細胞死亡[4]。通過有效的干預手段來減輕或預防I/R 損傷是重要的臨床課題。有研究[5]表明使用抗CD47單克隆抗體阻斷TSP1/CD47信號，或者敲除CD47，可以減輕小鼠心臟、腎臟、肝臟和組織皮瓣損傷。該研究采用大鼠原代心肌細胞低氧/復氧 (hypoxia/ reoxygenation，H/R) 損傷模型，從抗氧化及抗凋亡等方面探討抗體封閉CD47對體外培養心肌細胞H/R損傷的作用及其機制，旨在為其臨床應用提供基礎理論依據。

1 材料與方法

1.1動物出生1～3 d的SD(Sprague-Dawley)大鼠30只，雌雄不限，購自安徽醫科大學實驗動物中心。

1.2主要試劑胎牛血清、胰酶(Trypsin) 和二甲基亞砜(DMSO) 購自美國Sigma公司；乳酸脫氫酶(LDH，A020-1)、肌酸激酶(CK，A032)、超氧化物歧化酶(SOD，A001-1)、丙二醛(MDA，A003-1)和一氧化氮(NO，A012-1) 檢測試劑盒，購自南京建成生物工程研究所；噻唑藍(MTT)購自美國ENZO公司；DHE(dihydroethidium)購自美國Invitrogen公司；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(556547)購自美國BD Biosciences公司； CD47抗體(sc-53050)購自美國Santa Cruz Biotechnology公司；eNOS抗體 (32027)、p-eNOS抗體 (9570)和GAPDH抗體(5174)購自美國Cell Signal Technology公司。

1.3主要儀器低氧/高氧細胞培養箱(Model 3131)和普通細胞培養箱(HERACELL 150i)購自美國Thermo Scientific公司；96孔多功能酶標檢測儀(Eon)購自美國BioTeK公司；流式細胞儀(BD FACSCalibur)購自美國BD Biosciences公司。

1.4方法

1.4.1乳鼠心肌細胞分離和培養 參考文獻[6]方法，心肌細胞分離采用酶消化、差速貼壁法。心肌細胞培養液為90% DMEM、10%胎牛血清、青霉素100 U/ml、鏈霉素100 U/ml，以6×105/ml接種到6孔板，37 ℃、5% CO2培養箱中培養，每2 d換液1次，培養3～4 d用于實驗。

1.4.2心肌細胞H/R 模型的建立 原代培養3～4 d后呈亞融合狀態，低氧處理時，將細胞放入低氧/高氧培養箱中(1% O2，94% N2，5% CO2)37 ℃恒溫培養24 h；復氧處理時，從培養箱中取出細胞培養板，置于常氧培養箱中(95%空氣, 5% CO2, 37 ℃)培養12 h。常氧培養細胞用于對照。所有實驗重復3次。

1.5指標檢測

1.5.1心肌細胞活力檢測 采用MTT比色法檢測心肌細胞活力。細胞計數后在96孔板上以1×104/孔接種細胞。每孔加入20 μl MTT溶液，繼續培養4 h，吸出培養液。每孔加入二甲基亞砜(DMSO)100 μl，室溫低速震蕩30 min充分溶解。酶標儀測定各孔在570 nm波長的吸收值。細胞存活率=(實驗組光吸收值/對照組光吸收值)×100%。

1.5.2心肌細胞凋亡的檢測 使用AnnexinV-FITC/PI試劑盒檢測心肌細胞凋亡。細胞用PBS清洗3次，用0.25%胰酶消化，收集細胞，離心后用AnnexinV-FITC結合液重懸，制成單細胞懸液，加入AnnexinV-FITC和碘化丙啶(PI)室溫避光孵育10 min后，加入300 μl 1×緩沖液終止反應，混勻后流式細胞儀檢測。

1.5.3LDH、CK、SOD、MDA和NO水平檢測 收集各組細胞上清液，按照試劑盒說明書操作，使用酶標儀檢測LDH、CK、SOD、MDA和NO水平。

1.5.4活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)染色 細胞使用DPBS洗滌3次；加入DHE(10 μmol/L)，37 ℃避光孵育30 min；DPBS洗滌3次后熒光顯微鏡拍照。熒光定量使用Image J 軟件。

1.5.5Western blot 采用蛋白提取試劑盒提取細胞蛋白，使用BCA蛋白測定試劑盒進行蛋白定量，10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠進行電泳分離、轉膜。5%脫脂奶粉TBST溶液室溫封閉3 h 后，分別加入eNOS抗體(1 ∶1 000)、p-eNOS抗體(1 ∶1 000)和anti-GAPDH抗體(1 ∶1 000)。4 ℃孵育過夜，1×TBST洗3次，加入辣根過氧化酶標記的二抗，室溫孵育2 h，1×TBST洗3次，增強化學發光法顯色，凝膠成像系統拍照。蛋白表達定量使用Image J軟件。

表1 細胞培養上清液中LDH、CK、SOD、MDA和NO含量變化

與Control組比較：***P<0.001；與H/R組比較：##P<0.01，###P<0.001

2 結果

2.1各組心肌細胞存活率的比較心肌細胞低氧和復氧處理明顯增加了細胞死亡，與Control組(97.05±1.38)%比較，H/R組細胞存活率(39.46±2.96)%明顯下降(P<0.01)；CD47抗體處理增加了低氧和復氧損傷細胞的存活率，與H/R組相比，CD47+H/R組(78.52±4.39)%心肌細胞存活率顯著增加(P<0.01)。

2.2各組心肌細胞上清液中LDH、CK、SOD、MDA和NO水平的比較在H/R組中，CK、LDH和MDA的水平顯著高于Control組(P<0.01)，與H/R組相比，CD47+H/R組CK、LDH和MDA的水平顯著減少(P<0.01)。與Control組相比，H/R組SOD和NO水平明顯降低(P<0.01)；與H/R組比較，CD47+H/R組SOD和NO水平顯著增加(P<0.01)。各組心肌細胞的CK、LDH、MDA、SOD和NO水平見表1。

2.3各組心肌細胞凋亡率的影響在早期的凋亡中，磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine)表達于細胞膜。膜粘蛋白(annexin)對磷脂絲氨酸具有高親和性。異硫氰酸熒光素(Fluorescein isothiocyanate, FITC)標記的膜粘蛋白V(Annexin V)染色可以用于鑒別早期凋亡細胞。由于壞死細胞膜結構破裂或者疏松，PI能夠穿過細胞膜與DNA結合。因此可以用于區別凋亡細胞和正常細胞。與Control組相比，H/R組的細胞早期凋亡、晚期凋亡和總死亡率均顯著增高(P<0.01)，與H/R組比較，CD47+H/R組的細胞早期凋亡、晚期凋亡和總死亡率則明顯下降(P<0.01)。各組細胞流式檢測結果見表2。

表2 各組細胞凋亡比例

與Control組比較：***P<0.001；與H/R組比較：##P<0.01，###P<0.001

2.4各組心肌細胞ROS產生的比較熒光定量(圖1)結果表明，心肌細胞低氧/復氧處理明顯使細胞產生更多ROS，和Control組比較，H/R組熒光更強(P<0.01)；而CD47抗體封閉顯著減少細胞低氧/復氧處理后ROS的產生，和H/R組比較，CD47+H/R組熒光明顯減弱(P<0.01)。

圖1 Control組、H/R組和CD47+H/R組細胞ROS染色結果

A：各組心肌細胞ROS染色；B：各組心肌細胞ROS染色定量結果比較；與Control組比較：**P<0.01；與H/R組比較：##P<0.01

2.5各組心肌細胞eNOS/NO通路影響的比較定量結果(圖2)表明，三組細胞eNOS蛋白表達量無明顯差異；與Control組比較，H/R組p-eNOS表達明顯下降(P<0.01)，CD47表達明顯上升(P<0.01)；與H/R組比較，CD47+H/R組p-eNOS表達顯著上升(P<0.01)，CD47表達顯著降低(P<0.05)。

3 討論

CD47是一種具有五個跨膜域的蛋白質，在大多數細胞類型中廣泛表達并參與到先天免疫反應中。Bauer et al[9]報道在缺血狀態CD47在血管細胞中的表達顯著上調。CD47被TSP1激活后可通過降低鈣通量抑制eNOS活性從而減少NO的產生[10]。Sharifi-Sanjani et al[11]發現，CD47下調可以保護心臟壓力，緩解心臟衰竭，提高缺血性皮瓣和皮膚移植的存活率，同時也能抑制小鼠肝、腎I/R損傷[5]。離體心肌細胞H/R處理能夠造成心肌細胞損傷，同時也是模擬在體外環境下心肌I/R的常用模型。大鼠心肌發生I/R損傷后，表現為心肌細胞凋亡增多、胞質中CK、CK-MB、AST和LDH大量釋放。通過細胞凋亡率以及細胞培養基中CK、CK-MB、AST、LDH 含量的測定能夠反映心肌細胞的損傷程度[12]。本研究中CD47下調可增強eNOS/NO信號，從而激活eNOS并增加NO產生來緩解I/R的損傷。這一結果和Yao et al[13]研究結果一致。此外，CD47抗體處理引起體外培養的大鼠心肌細胞CD47表達下降，減輕了H/R心肌細胞損傷的作用，顯著降低了CK和LDH水平。

圖2 三組細胞CD47、eNOS、p-eNOS蛋白表達

與Control組比較：*P<0.05，**P<0.01；與H/R組比較：#P<0.05，##P<0.01

研究[14]證實, 氧化應激是I/R的主要病理表現。心肌細胞在I/R的過程中產生大量氧自由基，啟動氧化應激反應，導致線粒體功能紊亂，細胞損傷、凋亡和壞死。在心肌細胞發生H/R損傷過程中，細胞氧化應激也會被激活[15]。氧化應激主要由ROS介導,造成細胞內SOD、GSH-Px、VitC、VitE等抗氧化物質大量消耗，進而引起生物膜中脂質成分發生氧化并產生MDA。氧化應激在心血管疾病的發生發展過程發揮著重要作用，既可直接損傷細胞DNA誘導凋亡，還可以通過激活線粒體途徑等間接方式介導細胞凋亡。氧化應激介導的心肌細胞凋亡與心肌I/R的發生發展關系密切，是其發病機制中的重要環節之一[5]。研究[12]顯示，缺血和再灌注均可誘發心肌細胞凋亡，缺血是心肌細胞凋亡的啟動因素，再灌注損傷可加重心肌細胞凋亡，并使凋亡不可逆轉。因此抗氧化應激抑制凋亡成為探索這些疾病的發病機制及研制相關藥物的一個重要方向。本研究中，心肌細胞經H/R處理使氧化應激增加并降低了抗氧化能力；CD47下調增加心肌細胞抗氧化酶SOD的活性并減少了H/R心肌細胞MDA的產生。這些結果說明下調CD47可減少NADPH氧化酶源ROS的產生，增強細胞抗氧化能力并顯著減輕心肌細胞H/R引起的細胞凋亡。