調強放療前后外周血淋巴細胞及其亞群的變化分析

楊 婧，高 勁，肖 亮，王 芬，金問森，熊 那,4

放射治療(radiotherapy，RT)是治療中晚期腫瘤的重要方法，也是早期腫瘤手術后的補充手段，能夠明顯提高患者的生存時間。但是，RT在殺傷腫瘤細胞的時候，也會對機體的正常組織及細胞產生影響。一般來說，人體淋巴細胞對放射線有著較高的敏感性，而RT可引起部分淋巴細胞的再分布甚至死亡，從而導致人體免疫系統的改變[1]。隨著RT技術的日新月異，調強放療(intensity-modulated radiotherapy，IMRT)已被廣泛地應用于頭頸胸腹等全身各部位惡性腫瘤的治療，它具有靶區劑量高，而對正常組織損傷卻較小的特點[2]。該研究對183例常見腫瘤(肺癌、食管癌、鼻咽癌和直腸癌)患者IMRT前后的外周血淋巴細胞亞群的變化進行綜合分析，為今后在IMRT中更為有效地保護免疫系統，以及免疫調節方面的治療提供一定的研究依據。

1 材料與方法

1.1病例資料選取2015年10月～2017年11月安徽省立醫院西區放療科收治的食管癌、肺癌、鼻咽癌及直腸癌患者183例，其中男145例，女38例，年齡13～89歲，中位年齡58歲。入組標準：患者無免疫系統疾病，且入院前未接受其他免疫方面治療?；颊逫MRT前后行外周血淋巴細胞及其亞群檢測，其中66例行免疫功能測定，117例行調節性T細胞(regulatory T cells，Treg)檢測。患者一般資料見表1。

表1 患者的一般資料

1.2研究方法和試劑

1.2.1主要試劑 CD3、CD8、CD45、CD4、CD16、CD56、CD19、CD127鼠抗人單克隆熒光抗體均購自美國BD公司，紅細胞裂解液購自上海碧云天生物技術公司，其他均為國產市售常用試劑。

1.2.2放療方法 采用GE Discovery CT模擬定位機增強掃描后，掃描圖像傳輸至Pinnacle放療計劃系統，勾畫大體腫瘤體積(gross tumor volume，GTV)、大體腫瘤轉移淋巴結體積(gross tumor volume lymph gland，GTVnd)和相應淋巴引流區，即臨床靶體積(clinical targer volume，CTV)，通過3D外擴獲得計劃靶體積(planning targer volume，PTV)。依據GTV、GTVnd和CTV外擴的PTV，給予不同的放療劑量，周圍正常組織給予合理劑量限值，制定放療計劃進行照射。食管癌、肺癌、直腸癌放療劑量均在50～60 Gy，鼻咽癌為68～70 Gy。采用Varian trilogy 5339直線加速器，6 MV-X線照射，常規分割為1.8～2.2 Gy/次，1次/d，5 d/周，每周行kV級錐形束CT圖像引導，檢測和校正患者的放療體位。

1.2.3流式細胞儀(flow cytometry，FCM)檢測 患者分別于IMRT開始時和結束后1個月時抽取空腹靜脈血2 ml，乙二胺四乙酸鹽(EDTA)抗凝。取100 μl全血加入不同抗體的混合液20 μl，4 ℃避光孵育30 min。加入1 ml紅細胞裂解液，吹打混勻，裂解5 min，離心后棄上清液。PBS清洗細胞，重復2次，加入250 μl染色緩沖液重懸細胞后，采用FCM進行檢測，以FlowJo分析軟件進行淋巴細胞及亞群分析。

2 結果

2.1IMRT前后淋巴細胞總數的變化治療前淋巴細胞總數均值為(1.592±0.491)×109個/L，治療后的淋巴細胞總數均值為(0.739±0.342)×109個/L，以配對設計t檢驗進行統計學分析，結果顯示IMRT前后患者血液中的淋巴細胞總數差異有統計學意義(t=15.12，P<0.01)，表明IMRT可以導致腫瘤患者外周血中的淋巴細胞總數顯著降低。見圖1。

2.2IMRT前后總T(T)細胞、輔助性T(helperTcell,Th)細胞和抑制性/細胞毒性T(suppressorTcell/cytotoxicTcell,Ts/Tc)細胞的水平變化治療后的CD3+T細胞和CD3+CD4+Th細胞占淋巴細胞百分比(均值分別為68.200%±13.902%、27.871%±9.167%)明顯降低，與治療前(均值分別為71.251%±9.475%、40.739%±9.68%)相比較，T細胞平均下降3.05%(t=2.189，P<0.05)，Th細胞平均下降12.87% (t=9.962，P<0.01)，然而，治療后患者血液中的CD3+CD8+Ts/Tc細胞占淋巴細胞的百分比(均值37.405%±13.026%)升高，較治療前(均值28.439%±8.444%)平均增加8.96%(t=-6.403，P<0.01)。見圖2。進一步計算患者治療前的CD4+細胞/CD8+細胞比值為1.645±0.763，而治療后的CD4+細胞/CD8+細胞比值為0.862±0.466，差異有統計學意義 (t=9.339，P<0.01)。上述結果提示，IMRT導致患者血液中T細胞和Th細胞的百分比降低，Ts/Tc細胞的百分比較IMRT前升高，從而造成CD4+/CD8+比值的明顯下降。

圖1 IMRT前后患者血液中淋巴細胞總數的變化

2.3IMRT前后Treg的水平變化CD4+和CD25+是Treg細胞的標志，并且CD127低表達(CD127low/)為Treg細胞的重要標志，因此，進一步檢測患者治療前后血液中CD4+CD25+CD127low/-的Treg細胞占CD4+T細胞的百分比，治療前均值為6.270%±1.900%，治療后為5.802%±1.850%，如圖3所示，患者治療后血液中的Treg細胞水平下降，平均降低0.47%，與治療前比較，差異有統計學意義(t=2.17，P<0.05)。

2.4IMRT前后自然殺傷細胞(naturekillercell，NK)和B細胞的水平變化與T細胞和B細胞相比，NK細胞表面標志具有相對特異性，CD3-和CD16+、CD56+為NK細胞檢測的常用標記。CD3-CD16+CD56+NK細胞的檢測結果顯示，患者IMRT前外周血NK細胞占淋巴細胞百分比均值為19.420%±9.688%，IMRT后為23.723%±11.909%，與治療前外周血NK細胞水平相比增加4.3%，結果顯示差異有統計學意義 (t=-3.697，P<0.01)。由于CD19存在于除漿細胞以外的幾乎所有B細胞表面，因此，CD3-和CD19+常作為B細胞的檢測標記。檢測結果顯示，患者治療后CD3-CD19+B細胞水平(均值5.037%±4.106%)平均下降1.65%，與治療前(均值6.726%±3.240%)比，差異有統計學意義 (t=2.973，P<0.01)。見圖4。

圖2 IMRT前后血液中T、Th和Ts細胞的水平變化

3 討論

傳統放療可引起腫瘤患者血液中淋巴細胞總數的下降，這種效應的機制為放射線直接殺傷循環淋巴細胞和射線對骨髓的抑制導致淋巴細胞增殖和分化減少。在現代放療中，普遍采用IMRT治療腫瘤，其靶區精確度高，擺位誤差小，能最大限度的保護腫瘤附近的正常組織。其對骨髓的抑制作用也較小，因此，淋巴細胞數目的減少主要原因是IMRT的直接殺傷作用[3]。在本研究中觀察到IMRT引起患者外周血淋巴細胞的數量明顯下降，并且這種下降在治療結束后4周尚未完全恢復，提示盡管IMRT對機體正常組織損傷較小，但是對高度敏感性的淋巴細胞仍然具有很強的殺傷作用。

T淋巴細胞是形成并促進機體免疫應答的重要組分，其中CD3+CD4+Th細胞可通過擴增輔助B淋巴細胞產生抗體，并可活化其他的T細胞亞群，進而調節機體的免疫應答，在抗腫瘤和炎性反應的調節中具有重要作用，而CD3+CD8+Ts/Tc細胞則具有殺傷和抑制靶細胞的作用，在抗腫瘤方面能夠直接殺傷腫瘤細胞[4]。通常情況下，CD4+/CD8+細胞比例保持相對穩定，以達到機體免疫穩態。本研究中IMRT后患者外周血中的Th細胞百分比下降，而Ts/Tc細胞比例升高，導致CD4+細胞/CD8+細胞比值進一步降低，提示IMRT誘導了患者外周血中T細胞亞群的再分布。Tao et al[5]在鼻咽癌患者IMRT的研究中，發現治療后外周血Th細胞占淋巴細胞百分比與分期呈負相關，而CD4+/CD8+細胞比值降低可明顯增加腫瘤遠處轉移的風險。Yang et al[6]也發現前列腺癌放療有效的患者外周血中CD4+細胞/CD8+細胞比值明顯高于無顯著療效的患者。

CD4+CD25+Treg細胞是CD4+T淋巴細胞的一個亞群，能夠通過抑制T細胞的活化和增殖、下調白細胞介素-2(interleukin-2，IL-2)的分泌，以抑制抗腫瘤的免疫反應，同時在腫瘤治療中也起到維持免疫平衡、防止過度炎性反應和損傷的作用[7]。Foxp3+是CD4+CD25+Treg細胞的標志分子，而Foxp3+具有良好的相關性，CD4+CD25+CD127low/-細胞包含了絕大多數的Foxp3+細胞，通常情況下，以CD4+CD25+CD127low/-進行Treg細胞分選[8]。部分臨床研究[9-10]表明，放療可導致患者血液中Treg細胞的增加，與其他T淋巴細胞亞群CD127low/-與相比，Treg細胞的放射敏感性相對較低。而本項研究結果提示，腫瘤患者在IMRT結束后4周，外周血中Treg細胞的比例并未升高，反而出現降低，可能與檢測時間的差異和樣本數量有關。Cao et al[11]研究顯示，CD4+CD25+Treg細胞受到電離輻射后，其凋亡相關蛋白(caspase-3、Bax和CD95)都高于CD4+CD25-T淋巴細胞，從而導致CD4+CD25+Treg細胞具有高放射敏感性，與本項研究結果相似。

圖4 IMRT前后血液中NK和B細胞的水平變化

NK細胞屬于固有免疫細胞，在機體受到抗原和外界刺激時，首先快速啟動固有免疫應答，其中NK細胞表面高表達Fcγ受體(CD16)，與配體結合后，分泌腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)和干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)，發揮炎性反應和抗腫瘤作用，B細胞可分化為漿細胞，合成和分泌免疫球蛋白[12]。本研究結果顯示，IMRT患者外周血中的NK細胞百分比升高，而B細胞的百分比降低。此現象是由于NK細胞中含有大量還原型谷胱甘肽(reduced glutathione，GSH)，能夠有效清除由電離輻射激發水分子所形成的活性氧和自由基，具有很強的抗氧化能力，所以對電離輻射的耐受性高[3]，而Sage et al[3]和Jiang et al[13]則在腫瘤放療的研究中發現，B細胞與其他淋巴細胞亞群相比較，具有更高的放射敏感性。

綜上所述，IMRT可以導致腫瘤患者外周血淋巴細胞及其亞群的變化，從而對免疫功能產生影響，并且在治療后的短時間內不能恢復正常。因此，需要及早給予免疫調節治療，如IMRT過程中和結束的早期，以促進免疫平衡的恢復，預防輻射導致的過度炎性反應及誘發的二次致癌效應。