散發性結直腸癌微衛星不穩定狀態與臨床病理特征及預后的關系

蔣 娜，隋燕霞，蔣依娜，張冠軍

結直腸癌(colorectal cancer,CRC)是全世界第三高發惡性腫瘤，2015年CRC約占到全世界癌癥總數的9.7%[1]。CRC的發生是一系列復雜的基因疾病的結果。微衛星不穩定(microsatellite instability，MSI)的腫瘤被定義為免疫組化(immunohistochemistry,IHC)染色檢測有一個或多個錯配修復蛋白(mismatch repair protein，MMR)缺失或基因檢測表現出高頻微衛星不穩定(high frequency microsatellite instability，MSI-H)。MSI占散發性CRC的15%，其具有獨特的發生機制、預后、治療方案以及與林奇綜合征(Lynch syndrome，Lynch)有密切的關系。IHC法檢測MMR缺失的被認可和使用，使得檢測MSI變得簡便易行，有利于為腫瘤治療提供策略。秦云 等[2]證明此法的敏感度為94.9%，特異度為100.0%。目前關于MSI的研究不僅僅局限于發病機制上，其與CRC預后的關系也成為目前研究的熱點。該研究通過分析CRC的臨床病理特點與MSI的關系和隨訪CRC患者的生存狀態，探討MSI對中國人散發性CRC生存的影響。

1 材料與方法

1.1病例資料收集西安交通大學第一附屬醫院2014年1月～2016年12月經手術切除的CRC患者標本中213例的腫瘤組織與遠離腫瘤組織正常直腸黏膜組織,有家族性腺瘤性息肉病的患者被排除。另外，入選病例術前均未行放、化療。在分析的213例患者中，男118例，女95例；年齡19～92歲，中位年齡59歲，生存時間定義為自手術治療之日至末次隨訪日或死亡所經歷的時間，以月為單位計算。至研究終點(2017年12月)。依據2010版WHO組織學分級系統，將CRC分為高、中、低分化，如超過50%的腫瘤細胞表現為粘液分化，則被歸為粘液腺癌。

1.2研究方法標本經10%中性福爾馬林固定，常規脫水、包埋，4 μm切片，HE染色，光鏡觀察，并應用免疫組化Envision法染色。所用免疫組化一抗錯配修復蛋白MSH2(mutS homolog 2)、錯配修復蛋白MSH6(mutS homolog 6)、錯配修復蛋白MLH1(mutL homolog 1)、錯配修復蛋白PMS2(PMS1 homolog 2)及二抗[為鼠兔通用型抗體，二氨基聯苯胺(DAB)顯色]購自福州邁新公司。采用Ventana BenchMark XT system進行免疫組化染色。按照全部腫瘤細胞核均無著色方判定為該蛋白表達丟失。周圍間質細胞和浸潤淋巴細胞作為內對照。有MMR蛋白表達缺失的病例判定為MSI，未出現MMR蛋白表達缺失的判定為微衛星穩定(microsatellite stability,MSS)。MSI檢測采用PCR-毛細管電泳法檢測，選擇腫瘤及遠離腫瘤的正常切緣組織，采用德國Qiagen公司的DNA提取試劑盒(QIAamp DNA FFPE Kit)提取石蠟組織中的DNA，采用美國Promega公司的MSI檢測試劑盒特異性擴增Bat25、Bat26、NR-21、NR-24、MONO-27位點，使用美國ABI公司Applied Biosystems 3500對擴增產物進行檢測，使用GeneMapper4.1軟件進行數據分析。

1.3統計學處理采用SPSS 18.0軟件進行統計分析，計數資料比較采用χ2檢驗和Fisher確切概率法,生存分析采用Kaplan-Meier法并繪制生存曲線、Log-rank法比較組間生存時間的差異，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1CRC組織中MMR蛋白MLH1、MSH2、MSH6、PMS2免疫組化表達缺失率35例發生MMR蛋白表達缺失，見圖1，其中12例為MLH1蛋白和PMS2蛋白表達缺失；6例為MSH2蛋白和MSH6蛋白表達缺失；4例為MSH2蛋白表達缺失；12例為MLHl蛋白表達缺失；1例為MSH6蛋白表達缺失。本研究顯示MMR蛋白表達缺失病例多為腫瘤組織學分級為低分化，病理分型為粘液腺癌，右半結腸腫瘤，并與淋巴結轉移情況及分期相關，MSI患者中只有4例發生淋巴結轉移，大多數為Ⅱ期患者。而與患者年齡、性別、脈管浸潤、神經浸潤無顯著相關性。見表1。

圖1結直腸癌患者MMR表達情況×200

A：MSH2陽性；B：MSH6陽性；C：MLH1陽性；D：PMS2陽性；E：MMR蛋白陰性

2.2MSI檢測結果隨機抽取20例標本進行PCR-毛細管電泳法檢測，其中3例腫瘤組織顯示高頻微衛星不穩定(high frequency microsatellite instability，MSI-H)，其中1例腫瘤組織顯示低頻微衛星不穩定(low frequency microsatellite instability，MSI-L) ，其余腫瘤組織顯示MSS，見圖2。

2.3生存分析隨訪時間截止到2017年12月結束，41例(19%)的CRC患者死亡，均死于腫瘤復發轉移，隨訪時間12～48個月，中位隨訪時間25個月。12例(6%)患者失訪。同樣，MSI患者總體生存時間(overall survival time，OS)高于MSS患者，預后較好(OS：χ2=4.004，P<0.05)，見圖3。

3 討論

CRC在男女均是高發腫瘤，平均發病年齡62歲[3]。 Thibodeau et al[4]對導致Lynch綜合征的錯配修復基因進行微衛星研究，由此認識到一種定義為MSI的現象。MSI通路是由于DNA錯配修復基因失活而發生，約15%的散發性CRC是由此發生。其病因通常是人類MLH1錯配修復基因(human MutL homolog 1，hMLH1)啟動子甲基化，MMR基因沉默導致IHC顯示相關MMR蛋白陰性，表現MSI。然而，在散發性CRC，MSI的特征和重要性還知之甚少，并且MSI能否預測CRC患者預后仍有爭論。

表1 MSI和MSS 結直腸癌患者臨床病理特征的比較

本研究顯示，大約16%的腫瘤表現為MSI，這一結果與之前的研究[5]結果基本一致。而且采用PCR-毛細管電泳法檢測與IHC染色檢測MMR蛋白獲得的MSI-H比例一致。本研究結果還表明，MSI結直腸癌具有明顯的臨床病理特點，如多位于右半結腸，組織學多為粘液腺癌，組織學分級多為低分化，疾病分期早，淋巴結轉移少見。有文獻[6]報道MSI腫瘤多為女性，本研究沒有證實性別與其有關，因此對于MSI-H與性別是否有關尚存在爭議，有待進一步研究。 另外，值得注意的是有文獻[7]報道MSI腫瘤患者年齡分布具有特點，伴有MLH1超甲基化的患者與伴有MMR基因胚系突變的患者相比年齡較大，而后者則較年輕。在一些學者的研究[8]中表明MMR缺失的病例較少發生淋巴結轉移,這與本研究結果一致。還有些學者研究[9]表明MSI與腫瘤分期無關，但本研究顯示MSI-H病例多為Ⅱ期患者，這可能和散發性MSI-H結直腸癌異質性更高，研究所選區域不能完全反映腫瘤整體，以及病例數量有關。

圖2 PCR-毛細管電泳法檢測

圖3 結直腸癌患者的OS生存曲線

本研究顯示不論任何一種組織學亞型的CRC，只要伴有MSI, 生存期均有所提高。有學者研究[10]顯示伴有MSI的II期CRC患者6年生存率為97%，因此，這些患者手術后不需要輔助化療。這些都提示MMR蛋白表達狀態與CRC預后密切相關，并且可以很好地解釋本研究結果中伴有MSI的腫瘤淋巴結轉移的減少。雖然MSI檢測是金標準，但IHC檢查MMR蛋白性價比較高，更易于患者接受，因此所有CRC患者特別是<60歲患者都應進行篩查。IHC檢查MMR蛋白為患者病情轉歸和化療療效提供預測，影響患者治療策略的選擇，并提示Lynch綜合征，促進腫瘤的個體化治療。

伴有MSI的CRC之所以有良好的預后是因為腫瘤本身的組織學特點。腫瘤組織周圍以淋巴細胞為主的增強的炎癥反應可能有助于生存時間的延長。目前本研究缺乏炎癥反應方面的資料，但關于這一組織學特點的研究未來可能會成為研究的熱點。

有研究[11]顯示MMR蛋白缺失的Ⅲ期和Ⅳ期CRC患者發生腫瘤轉移的比例較低，并且OS顯著提高。散發性伴有MSI的CRC患者與染色體不穩定(chromosomal instability,CIN)途徑發生CRC的患者相比預后較好。這一結果可能是由于p53和K-ras基因突變在伴有MSI的CRC較為少見。本研究的病例中，MSI患者以Ⅱ期腸癌為主，同時具有更長的總體生存時間，Ⅲ期和Ⅳ期患者相對較少，其中伴有MSI的病例則更少，因此微衛星狀態對Ⅲ期和Ⅳ期CRC患者預后的影響了解較少。