miR-103和miR-107表達水平與變應性鼻炎患病風險、疾病嚴重程度和炎癥水平的關聯分析

熊 穎， 張 瓊， 袁 琨

變應性鼻炎(allergic rhinitis，AR)是一種發生在鼻黏膜的過敏性、炎癥性疾病，在亞洲的患病率達到27%～32%[1-3]。同時，AR患者的鼻黏膜癥狀嚴重降低了患者的學習、工作和生活質量，更增加了患者患其他黏膜組織過敏性和炎癥性疾病的風險，如哮喘和結膜炎[4]。由于環境惡化等其他因素的加重，AR的發病率仍在上升，且目前的藥物治療不能緩解約20%患者的癥狀。因此，尋找一個可靠的可用于輔助診斷和疾病監測的生物標志物十分緊迫[5-8]。近年來，微小RNA(microRNA，miR)被報道可以作為輔助AR診斷和預后的生物標志物[9-11]。miR-103和miR-107是位于10號染色體上的屬于同一基因家族的miRNA，被發現在許多炎癥疾病中發揮著抑制炎癥并阻止疾病進展的作用，可以作為一些炎癥疾病的風險和疾病監控標記物[12-13]。本研究旨在評估鼻黏膜組織miR-103和miR-107表達量與AR患病風險、疾病嚴重程度和炎癥因子水平的關聯。

1 對象與方法

1.1對象 選取2017年5月—2018年4月收治的80例AR患者。入選標準：(1)經病史、臨床癥狀、鼻腔檢查、皮膚點刺實驗及血清變應原特異性IgE檢測，根據文獻[14]確診的AR；(2)同意獲取鼻黏膜組織；(3)4周內未接受抗組胺藥物和糖皮質激素治療。排除標準：(1)AR合并哮喘發作；(2)解剖學因素或其他因素造成鼻腔堵塞，包括嚴重的鼻中隔偏曲、鼻息肉和鼻竇炎等；(3)呼吸系統疾病，包括支氣管哮喘、分泌性中耳炎等；(4)上呼吸道感染或其他嚴重感染；(5)合并惡性腫瘤；(6)孕婦或哺乳期婦女。入組的AR患者的年齡為(24.2±7.4)歲(10～41歲)，男性35例(43.8%)，女性45例(56.3%)，單個鼻癥狀評分(individual nasal symptom score，INSS)包括流涕、鼻癢、噴嚏、鼻塞評分分別為(1.9±0.7)分(1.0～3.0分)，(1.9±0.6)分(1.0～3.0分)，(2.3±0.7)分(1.0～3.0分)，(1.9±0.7)分(1.0～3.0分)，總鼻癥狀評分(totalnasalsymptomscore，TNSS)為(7.9±1.6)分(4.0～11.0分)；血清IgE水平中位值為270.7 IU/mL(四分位值：163.7～479.5)(30.6～1 318.1 IU/mL)。同期收集80例行鼻中隔偏曲手術矯正患者的鼻黏膜組織作為對照，所有對照組均無AR、哮喘史、呼吸道感染或其他嚴重感染、惡性腫瘤史。對照組年齡為(25.8±8.8)歲(5～48歲)(P>0.05)，其中男性40例(50.0%)、女性40例(50.0%)(P>0.05)，血清IgE水平中位值為22.4 IU/mL(四分位值：15.3～32.7)(5.8～59.0 IU/mL)(P<0.001)。本研究經倫理審查委員會批準，且所有受試者或其監護人均已簽署知情同意書。

1.2AR嚴重程度評估 采用INSS和TNSS評估AR嚴重程度。INSS為患者自評，包括4種鼻癥狀評分，分別為流涕、鼻癢、噴嚏、鼻塞。每一種癥狀由患者根據以下標準進行評分：0分為無癥狀；1分為輕度癥狀；2分為中度癥狀；3分為重度癥狀。4種INSS之和即為TNSS[15]。

1.3組織標本收集 局部麻醉下取受試者下鼻甲前端黏膜組織，用無菌生理鹽水漂洗、干燥后，置于凍存管中，放入液氮速凍，置于-80℃保存，待后續檢測。

1.4miR-103，miR-107及炎癥因子mRNA檢測 采用RNeasy Protect Mini Kit(德國QiagenInc公司)試劑盒提取患者和對照組鼻黏膜組織中的總RNA，將總RNA采用ReverTra Ace?qPCR RT Master Mix(日本Toyobo公司)逆轉錄為互補DNA(complementary DNA, cDNA)。采用THUNDERBIRD?SYBR?qPCR Mix(日本Toyobo公司)試劑盒進行聚合酶鏈式反應(poly merase chain reaction，PCR)。采用U6作為miR-103和miR-107的內參，采用NAPDH作為炎性因子腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)，IL-1β，IL-4，IL-6，IL-13，IL-8，IL-10，IL-17mRNA的內參，最后通過2-△△ct公式計算miRNA和mRNA的相對表達量。定量PCR(quantitive PCR，qPCR)中采用的引物序列見表1。

表1 引物序列Tab 1 Sequences of the primers

miR:微小RNA； TNF-α：腫瘤壞死因子-α； IL：白細胞介素.

1.5樣本量計算 本研究前期進行預試驗。預試驗中隨機選取6例AR患者的鼻黏膜組織，并采集6例年齡和性別與患者相匹配、行鼻中隔偏曲手術矯正患者的鼻黏膜組織作為對照，采用qPCR檢測miR-103及miR-107的相對表達量：miR-103在患者和對照組中的相對表達量分別為(0.525±0.370)，(1.809±1.020)；miR-107在患者和對照組中的相對表達量分別為(0.570±0.477)，(1.671±0.873)。取I類錯誤α=0.05，Ⅱ類錯誤β=0.1(把握度為90%)，以預試驗中miR-103在患者和對照組中的相對表達量為估計值，進行差異性檢驗所需最小樣本量為每組10例；以預試驗中miR-107在患者和對照組中的相對表達量為估計值，進行差異性檢驗所需最小樣本量為每組11例。為盡可能減少預試驗中抽樣誤差對于樣本量估計帶來的偏倚，將研究樣本量擴大到每組80例。

2 結 果

2.1miR-103/miR-107與AR患病風險的關聯 miR-103在AR和對照組鼻黏膜組織的表達量中位值(1/4分位值～3/4分位值)分別為0.512(0.273～0.894)和0.990(0.554～2.438)；miR-107為0.462(0.265～0.726)和1.710(1.089～2.786)。AR患者的鼻黏膜組織miR-103和miR-107的表達量顯著低于對照組，差別有統計學意義(P<0.001，圖1A,B)。ROC曲線分析顯示，鼻黏膜組織miR-103表達量可以在一定程度上預測AR的患病風險，其AUC為0.752(95%CI：0.678～0.826)(圖1C)；鼻黏膜組織miR-107表達水平對AR患病風險具有較好的預測作用，其AUC為0.886(95%CI：0.834～0.939)(圖1D)。通過計算特異性和敏感性的和，找到和最大處(最佳切割點)miR-103/miR-107的表達量，即為miR-103/miR-107的截斷值，其中miR-103的截斷值為0.797，其對于預測AR患病風險的敏感性為73.8%，特異性為65.0%；miR-107的截斷值為1.007，其對于預測AR患病風險的敏感性為86.3%，特異性為81.3%。另外，AR患者和對照組鼻黏膜miR-103表達量和miR-107表達量均正相關(P<0.001，圖1E，F)。

AR：變應性鼻炎. A：鼻黏膜miR-103在AR患者與對照組中的相對表達量； B：鼻黏膜miR-107在AR患者與對照組中的相對表達量； C：鼻黏膜miR-103相對表達水平對AR患病風險的ROC曲線； D：鼻黏膜miR-107相對表達水平對AR患病風險的ROC曲線； E：AR患者中鼻黏膜miR-103表達水平與miR-107表達水平的關聯； F：對照組中鼻黏膜miR-103表達水平與miR-107表達水平的關聯.圖1 miR-103和miR-107與AR患病風險的關聯Fig 1 The correlations of miR-103 and miR-107 with AR risk

2.2miR-103/miR-107與AR患者疾病嚴重程度的關聯 AR患者鼻黏膜的miR-103表達量與鼻癢評分、鼻塞評分和TNSS均呈負相關(表2)，與鼻癢評分、鼻塞評分(P=0.001)和TNSS均呈負相關。將AR患者根據鼻黏膜的miR-103/miR-107表達水平截斷值分為miR-103/miR-107高表達患者和miR-103/miR-107低表達患者，比較INSS和TNSS在兩組間的差別，結果顯示，miR-103低表達患者的鼻癢評分、鼻塞評分和TNSS顯著高于miR-103高表達患者(P<0.05)，而流涕評分和噴嚏評分在miR-103低表達患者和miR-103高表達患者的差別無統計學意義(P>0.05，表3)。miR-107低表達患者和miR-107高表達患者間的流涕評分、鼻癢評分、噴嚏評分、鼻塞評分和TNSS比較，差別無統計學意義(P>0.05)。

表2AR患者中miR-103/miR-107相對表達量與疾病嚴重程度的關聯
Tab 2The correlations of miR-103/miR-107 expression with disease severity in AR patients

項 目miR-103P值相關系數(r)miR-107P值相關系數(r)流涕評分0.9060.0130.179-0.152鼻癢評分<0.001-0.3990.022-0.256噴嚏評分0.152-0.1620.133-0.170鼻塞評分<0.001-0.4090.001-0.371TNSS<0.001-0.410<0.001-0.390

AR:變應性鼻炎； TNSS：總鼻癥狀評分.

表3疾病嚴重程度在miR-103/miR-107高表達和低表達患者中的差異
Tab 3The difference in disease severity between patients with miR-103/miR-107 high expression and patients with miR-103/miR-107 low expression

項 目miR-103高表達低表達miR-107高表達低表達流涕評分1.8±0.61.9±0.71.7±0.61.9±0.7鼻癢評分△1.6±0.72.0±0.51.6±0.71.9±0.5噴嚏評分2.1±0.92.3±0.62.1±0.92.3±0.7鼻塞評分△1.5±0.72.1±0.71.6±0.82.0±0.7TNSS△7.0±1.58.3±1.57.1±1.98.0±1.5

2.3miR-103/miR-107與AR患者炎癥因子的關系 AR患者鼻黏膜的miR-103表達量與鼻黏膜TNF-α，IL-4，IL-6，IL-13，IL-17 mRNA表達量呈負相關，與IL-10表達水平呈正相關；miR-107表達量與TNF-α，IL-6，IL-8，IL-13，IL-17 mRNA表達水平呈負相關，與IL-10表達量呈正相關(表4)。對照組的miR-103表達水平與TNF-α，IL-4，IL-6，IL-8，IL-13，IL-17 mRNA表達量呈負相關，與TNF-α，IL-1β，IL-4，IL-8 mRNA呈負相關(表5)。

表4AR患者中miR-103/miR-107相對表達量與炎癥因子mRNA的關聯
Tab 4The correlations of miR-103/miR-107 expression with inflammatory cytokines mRNA levels in AR patients

項 目miR-103P值相關系數(r)miR-107P值相關系數(r)TNF-αmRNA<0.001-0.3970.003-0.331IL-1βmRNA0.123-0.1740.117-0.177IL-4mRNA0.025-0.2500.059-0.212IL-6mRNA0.001-0.3540.014-0.273IL-8mRNA0.064-0.2080.008-0.297IL-10mRNA0.0020.3400.0420.228IL-13mRNA0.005-0.3080.038-0.233IL-17mRNA<0.001-0.4070.005-0.312

AR：變應性鼻炎； TNF-α：腫瘤壞死因子-α；IL：白細胞介素.

3 討 論

本研究發現：(1)鼻黏膜miR-103和miR-107表達量在AR患者中低于對照組，且miR-103可在一定程度上預測AR的患病風險，miR-107對AR患病風險有較好的預測作用；miR-103和miR-107表達水平在AR患者中和對照組中均呈正相關；(2)AR患者miR-103和miR-107表達水平與AR疾病嚴重程度呈負相關；(3)AR患者miR-103和miR-107表達量與促炎因子水平呈負相關，與抑炎因子水平呈正相關。

表5對照組中miR-103/miR-107相對表達量與炎癥因子mRNA的關聯
Tab 5The correlations of miR-103/miR-107 expressions with inflammatory cytokines mRNA levels in controls

項 目miR-103P值相關系數(r)miR-107P值相關系數(r)TNF-αmRNA0.012-0.2790.014-0.275IL-1βmRNA0.124-0.1730.049-0.221IL-4mRNA0.025-0.2510.012-0.278IL-6mRNA0.040-0.2300.064-0.208IL-8mRNA0.015-0.2710.034-0.237IL-10mRNA0.1330.1700.3290.111IL-13mRNA0.012-0.2810.058-0.213IL-17mRNA0.076-0.2000.056-0.214

TNF-α：腫瘤壞死因子-α；IL：白細胞介素.

miR-103被報道在與炎癥相關的疾病中發揮促進疾病進展的作用。研究表明，miR-103可以通過調控Bcl2/腺病毒E1B19kDa相互作用蛋白3(Bcl2/adenovirusE1B19 kDainteractingprotein，3BNIP3)減少人臍靜脈血管內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)中的氧化應激損傷，從而在心血管疾病中起到保護作用[13]。另一項實驗表明，下調小鼠下丘腦miR-103表達水平顯著升高了PI3K-Akt-mTOR通路的表達水平，導致小鼠發生食欲過盛型肥胖，增加了2型糖尿病的患病風險[16]。一項關于阿茲海默癥(Alzheimer′s disease，AD)的細胞實驗報道，miR-103在AD細胞模型中通過調控前列腺素內過氧化物合酶2(prostaglandin-endoperoxidesynthase2，PTGS2)促進了神經細胞的生長，且抑制了神經細胞的凋亡和炎癥，表明其在AD中發揮了保護作用[17]。這些研究表明，miR-103在與炎癥相關的疾病中發揮抑制疾病進展的作用，包括通過調控多種蛋白以及信號通路減少氧化應激損傷、促進細胞生長、抑制細胞凋亡和細胞中的炎癥反應等。本研究發現，鼻黏膜miR-103表達水平在AR患者中顯著低于對照組，ROC曲線顯示其可以在一定程度上預測AR的患病風險，且與疾病嚴重程度和炎癥水平呈負相關，可能與miR-103在炎癥相關疾病中的保護作用有關，如通過調控3BNIP3蛋白減少HUVEC中的氧化應激損傷等[13,16-17]。

miR-107與miR-103屬于同一基因簇，且同樣被發現在多種炎癥相關的疾病中發揮著抑制炎癥反應等保護作用[18]。研究表明，高壓氧抑制了髓核細胞中HMGB1/RAGE信號相關通路并升高miR-107表達水平，從而減輕了炎癥反應，在腰椎間盤退行性病變中發揮了治療作用[19]。近期的體外實驗表明，miR-107可以通過KRT1依賴的Notch信號通路減少在冠狀動脈硬化小鼠血管內皮細胞中的炎癥反應和內質網應激反應[12]。另一項研究表明，丙型肝炎病毒(hepatitis cvirus,HCV)可通過降低miR-107和miR-449的表達水平，靶向調控白介素6復合受體從而調控炎性因子CCL2，促進HCV患者肝臟組織中的炎癥反應[20]。另外，有大鼠實驗表明，丹參乙酸鎂可通過調控miR-107/谷氨酸轉運體1信號通路緩解缺血再灌注損傷，且體外實驗結果顯示，注射丹參乙酸鎂可顯著升高miR-107的表達水平[21]。以往的這些實驗表明，miR-107是一個抑炎基因。本研究中，鼻黏膜miR-107在AR患者中顯著低表達，且與疾病嚴重程度和炎癥水平呈負相關，說明其在AR中或許發揮抑制疾病進展的作用，這個結果可能和以往研究發現的miR-107在多種疾病中通過調控多種通路或蛋白減輕炎癥反應有關，包括：(1)通過調控多種信號通路減少細胞中的炎性反應；(2)通過調控相關通路減輕內質網應激反應；(3)通過調控炎性因子表達水平減輕炎癥等[12,19-21]。另外，筆者還發現，在AR和對照組患者中，鼻黏膜miR-103和miR-107表達水平均呈顯著正相關，或許表明miR-103/miR-107在AR中共同發揮著抑制疾病進展的作用。

本研究還存在一些缺陷：本研究納入樣本量較小，可能導致統計效能不足；作為一項單中心研究，大部分患者來自同一地區，造成了選擇偏移；miR-103和miR-107在AR中的具體分子作用機制尚未研究。