芽孢桿菌在中國白酒釀造中的應用機理研究進展

羅 莉，李 欣，常 煦，李兆飛，賈 盼，李志軍

（1.湖北三峽職業技術學院農學院，湖北宜昌443003； 2.湖北工業大學生物工程學院,發酵工程教育部重點實驗室，湖北武漢430068； 3.安琪酵母股份有限公司釀造與生物能源事業部，釀造與生物能源研究所，湖北宜昌443003）

芽孢桿菌是環境中存在非常廣泛的一類微生物，在現代生物技術的幫助下，芽孢桿菌已經廣泛應用于諸如飼料、生物農藥等重要領域[1-3]。在白酒釀造領域，隨著對釀造中微生物的不斷探索和發酵機理的研究，越來越多的數據和報告顯示，芽孢桿菌在白酒釀造中也占有非常重要的地位，多菌種共發酵是白酒發酵區別于絕大多數酒種發酵的主要特征之一，而芽孢桿菌在中國主流大曲白酒發酵中確實起著非常重要的作用[4-8]。

中國傳統白酒固態發酵是以自然微生物環境為基礎，以水分、溫度等宏觀參數調控為主的發酵方式，因此該發酵過程受環境因素影響很大，而且難以控制?，F代釀造學的核心是微生物，通過對微生物生理生化過程的了解，可以從微觀上精確的對釀造過程進行調控，從而達到釀造工藝升級的目的[9]。本文就芽孢桿菌目前在白酒釀造中的整個研究及應用情況做一個綜述性匯總，同時闡述該類微生物工業應用的可行性及應用方向，供白酒企業研發及相關生產人員參考。

1 芽孢桿菌在不同香型白酒的研究進展

“曲”在中國白酒釀造中占有極重要的地位，所謂“曲為酒之骨”，可以說“曲”決定了中國白酒釀造的風格特點。曲從實質上說，是一個微生物以及酶系的復雜組合系統，制曲的過程實際上就是一個微生物篩選、擴大培養以及所產酶系富集的過程[10]。很多學者利用“曲”這一本質特點，開始對曲中的有益微生物加以區分和研究，芽孢桿菌就是其中一類微生物。

1.1 芽孢桿菌在醬香型白酒中的研究進展

從目前國內白酒領域對芽孢桿菌的研究可以看出，最主要的還是集中在醬香型白酒大曲中，現有的研究報告中，超過80%的研究都與醬香型白酒大曲相關，足以說明芽孢桿菌在醬香型白酒生產中的重要地位。醬香型大曲是典型的高溫曲，在制曲過程中，品溫會高達60℃以上，在這個溫度條件下，絕大多數霉菌、酵母菌難以存活，而在這種條件下，一些具備耐溫性能的芽孢桿菌以及曲霉就被自然篩選了出來，作為醬香型大曲的基礎菌[11]。

通過研究發現，在醬香型酒曲中，芽孢桿菌的數量占有絕對地位。楊代永等對茅臺酒曲中的微生物進行分析后發現，在成熟酒曲中，芽孢桿菌的微生物數量占比近80%，其他為曲霉和極少量的酵母[12]。在楊帆等的后續研究中，發現在茅臺酒極易分離的芽孢桿菌中，有3種芽孢桿菌，地衣芽孢桿菌MTDB-01、地衣芽孢桿菌MTDB-02和枯草芽孢桿菌MTDB-03分別占了細菌總數的28%、37%和23%，說明在茅臺酒發酵過程已經形成了比較固定的芽孢桿菌發酵系統比例。對這3株芽孢桿菌進行了發酵性能分析，結果顯示，通過芽孢桿菌發酵后生成了乙偶姻、三甲基吡嗪等10余種風味成分，通過與大曲主要揮發成分進行比較后，確認這3株芽孢桿菌為大曲風味物質形成的主要功能菌[13]。

研究認為，芽孢桿菌在醬香型白酒生產過程中，對于醬香型風味的生成有著至關重要的作用。張榮對醬香型大曲發酵液進行風味分析后，將乙偶姻、四甲基吡嗪和呋喃扭爾作為特征風味物質。然后對1株從醬香型大曲中分離到的地衣芽孢桿菌（Bacillus lichenifoumis）進行了風味發酵分析后發現，該芽孢桿菌可以通過發酵直接生成乙偶姻，而且更加明確的是，在55℃高溫環境下，芽孢桿菌3-羥基丁酮的生成量明顯要高于37℃、45℃，進一步說明了高溫堆積對該類物質生成的促進作用[14]。

1.2 芽孢桿菌在其他香型白酒中的研究進展

中國學者幾乎從所有的酒種酒曲中都分離到了芽孢桿菌。王海燕等對清香型小曲中的微生物組成及功能進行了詳盡的分析，其中發現芽孢桿菌類是普遍存在的細菌類微生物[15]。此外，該學者還對不同工藝大曲中的微生物進行了系統的分析，研究發現，溫度是影響大曲中細菌組成的重要因素。數據顯示，在濃香型大曲與芝麻香型大曲比較中，芽孢桿菌的數量占到了芝麻香型大曲微生物總體的33.64%，而濃香型大曲中只占2.4%[16]。葉光斌對清香型大曲細菌菌落結構進行了分析比較后發現，在3種清香大曲（清茬曲、后火曲、紅心曲）中，后火曲和紅心曲細菌中，芽孢桿菌所占的比例要明顯高于清茬曲，這個也從側面說明了在制曲過程中，溫度是對芽孢桿菌篩選和擴配的核心因素之一[17]。上述報告結果說明，在小曲清香、大曲清香以及濃香型大曲中都可以檢測到芽孢桿菌的存在，而另外一些學者已經將芽孢桿菌對非醬香型白酒的影響做了一些研究和分析。

表1 芽孢桿菌產酶特性研究進展

曹振華等在瀘型（濃香型）大曲中考察了大曲中的芽孢桿菌數量、霉菌數量以及酵母菌的數量和酒曲等級優劣的關系發現，曲香＞10的優質大曲，這3類微生物的數量均高于曲香≤10的大曲，尤其是芽孢桿菌的數量前者是后者的13.5倍，由此可以確定芽孢桿菌對瀘型大曲質量有重要作用。同時，不同等級的瀘型大曲在酯化力、發酵力方面的差異不大，在此基礎上通過曲香對曲質的等級進行劃分，從側面上也說明了芽孢桿菌對于濃香型大曲的重要作用[18]。曾婷婷等通過應用芽孢桿菌菌液參與特香型酒發酵，發現在芽孢桿菌的輔助下，可以有效提高酒基中總酸、總酯和主要風味物質的含量，而對于多元醇的生成芽孢桿菌無明顯影響[19]。楊春霞等從牛欄山地缸酒醅中篩選出5株芽孢桿菌，分別為地衣芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）、短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），通過對這些芽孢桿菌發酵風味物質進行鑒定后發現，不同的芽孢桿菌發酵對風味貢獻差異較大，其中地衣芽孢桿菌產生較多的酯類和含氮化合物，蠟狀芽孢桿菌與酯類和醛酮類化合物的合成更為緊密，短小芽孢桿菌有更多的烴類和醇類物質生成，而枯草芽孢桿菌的生成物中主要為雜環類化合物；報告同時指出，雖然不同芽孢桿菌的生成物有較大差別，但所有的芽孢桿菌都有一種共有產物乙偶姻[20]。

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2 芽孢桿菌作用機理研究進展

作為已經明確的重要釀造微生物，需要對芽孢桿菌在白酒釀造中的作用機理進行研究。一方面，了解芽孢桿菌的作用機理可以為發酵調控提供理論及數據支撐。另外，還可以根據已知作用機理對芽孢桿菌進行商品化以及應用技術做出指導。

2.1 芽孢桿菌酶系研究進展

芽孢桿菌具有很強的酶產生能力，其中研究比較多的諸如枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌等具有較強的產蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶能力。此外，一些芽孢桿菌還具有降解木聚糖、果膠、地衣聚糖等物質的能力[21]。目前對于芽孢桿菌酶系研究比較廣泛的主要分布在飼料領域，而對于白酒領域芽孢桿菌的產酶及相關特性研究還處在比較初級的階段，但不可否認的是，芽孢桿菌所產酶在白酒釀造領域發揮著重要的作用。近年來對芽孢桿菌產酶特性的研究進展見表1。

如表1所示，芽孢桿菌在蛋白酶、淀粉酶以及纖維素酶方面都具有一定的優勢。從固態白酒發酵特點看，這些酶類的生成和富集可以有效降解原料中的蛋白、淀粉以及纖維素類物質，這樣可以提高原料利用率、為微生物發酵提供必要的營養元素以及為一些風味物質提供必要的前體。但芽孢桿菌的生物酶系在白酒釀造中的作用過程還需要進一步進行研究和探索。

2.2 芽孢桿菌風味物質合成機理研究進展

在前面的論述中，可以明確的是芽孢桿菌是中國白酒釀造中的一類重要微生物。中國白酒是注重風味的發酵食品，而產生這些特征風味的核心因素還是微生物的作用，而芽孢桿菌在白酒釀造中對白酒風味的影響自然成為學者研究的重點[26-27]。近年來對于芽孢桿菌和風味成分的關系機理的研究，大體上可分為兩方面的研究，芽孢桿菌的直接發酵風味和間接發酵風味的研究。

2.2.1 芽孢桿菌直接發酵風味研究

芽孢桿菌在生長發酵過程中，一方面產生豐富的酶系對原料加以分解，另外通過復雜的生理生化過程，合成豐富的風味物質。黃永光等對枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌以高粱、小麥為培養基對這3種芽孢桿菌的生成物進行詳盡分析，結果顯示，不同芽孢桿菌在培養后均可以直接形成非常復雜的風味，雖然最終風味各有特色，但在一些特征產物諸如3-甲基丁醇、2,3-二丁醇、3-羥基-2-丁酮以及吡嗪類等都有非常相似的代謝產物組分；該作者對風味物質產生代謝途徑進行非常詳細的分析，結果見表2[28]。

表2 醬香型白酒中主要產香風味的3類芽孢桿菌的主要風味成分代謝途徑

在芽孢桿菌風味代謝產物機理研究過程中，無論是醬香型、濃香型還是清香型大曲中所分離的芽孢桿菌，都有一個相同的代謝產物3-羥基-2-丁醇。該產物是芽孢桿菌直接生物代謝所得，該物質是重要的呈香物質，同時對芽孢桿菌發酵性能優劣具有指向作用。

白酒風味是一個非常復雜的體系，芽孢桿菌除了通過自身發酵所得到的直接風味物質外，還可以產生一些風味合成前體物質，通過一些化學或者生物作用來進一步合成復雜的風味物質。

2.2.2 與芽孢桿菌相關的間接風味物質生成機理

在間接風味物質產生研究中，目前主要分為兩個主要的方面，一個是研究比較早的美拉德反應，另外一個是現在逐漸興起的微生物協同發酵研究。

早在20世紀90年代初，劉曉光等[29]就對芽孢桿菌參與下的美拉德反應和醬香風味物質產生進行了實驗和論述，初步確認了通過芽孢桿菌對原料的分解，一些氨基酸得到了積累，而后通過美拉德反應產生復雜醬香的這一過程。在之后的20多年間，包括謝和、莊名揚等都在美拉德反應與醬香型白酒風味物質產生方面做了更深入的研究[29-30]。四甲基吡嗪是醬香型白酒的重要風味物質，吳建峰針對該物質進行針對性的探索后明確發現，四甲基吡嗪的合成需要兩個階段：第一階段是在中低溫條件下，通過細菌產生3-羥基丁酮和氨；而第二階段屬于標準的美拉德反應，通過在高溫條件下，3-羥基丁酮和氨進行縮合反應，最終形成四甲基吡嗪。在這個研究中，通過菌種及發酵模型建立，與傳統方法發酵相比，曲中的四甲基吡嗪含量提高了4倍，最終酒體中四甲基吡嗪的含量提高了7.5倍[31]，該研究結果非常清晰地說明了四甲基吡嗪的合成途徑，其中該物質的重要合成前體3-羥基丁酮是芽孢桿菌非常重要的發酵產物。事實上，關于芽孢桿菌與美拉德反應和白酒風味的研究并不多，目前主要集中在醬香型白酒領域，相關機理研究已經可以支撐和明確，為微生物工業應用進行指導和問題解決。

除了上述的美拉德反應以外，以芽孢桿菌代謝產物為基礎，通過多種微生物協同也開始進行初步的探索。中國白酒是一個復雜微生物發酵體系，其中所發生的各種生物反應及化學反應不計其數，探索微生物間的協同作用可以更好的解析白酒發酵過程。孟醒、徐巖等[32]研究了釀酒酵母與地衣芽孢桿菌的相互作用，并從蛋白組學的角度對其作用機制進行了分析，研究結果顯示，釀酒酵母與芽孢桿菌協同生長下，酵母對芽孢桿菌的拮抗作用比較明顯，雖然釀酒酵母本身生長沒有受到影響，但是其代謝產物發生了顯著的變化，在協同發酵狀態下，酵母所產生的乙醇及有機酸中的丙酮酸、蘋果酸、乳酸、琥珀酸以及酒石酸的產量分別高出純培養的11.8%、56.8%、36.3%、24.3%、48.2%及27.7%，至于出現這個現象的原因，該學者從蛋白組學上進行了解析，通過地衣芽孢桿菌的誘導作用，釀酒酵母內的69個蛋白差異表達出現了高達2倍的差異，這是生物代謝產生明顯差異的原因。

通過眾多科研人員的研究，可以明確在中國固態白酒釀造過程中，芽孢桿菌是一類非常重要的微生物，其生物作用直接影響到白酒核心風格的形成，所以對于該類微生物的作用機理以及與其他微生物的協同作用將會是后續關注的重點。

3 前景和展望

依靠環境微生物進行發酵的中國白酒，尤其是大曲固態白酒發酵帶來了獨一無二的風味風格和地域特色。但換句話來說，這種發酵方式也在一定程度上阻礙了行業的現代化發展路線。以中國勁酒為例，其在近些年通過結合現代化設備改造，配合先進的自動化控制技術，對白酒釀造工藝進行了大膽的創新，實現了生產效率成倍提高、產品品質穩定提升、生產降耗明顯，并顯著提升了企業的管理水平，更為重要的是，這種改變將使白酒風格穩定，異地生產成為可能，這種改變成為未來中國白酒發展的方向之一[33]。

芽孢桿菌目前已經實現了商業化應用，在飼料、環保領域，對芽孢桿菌的應用已經成為普遍的共識并已形成業內通用的應用方式和工藝。而在白酒釀造領域，越來越多的學者經過不斷的努力探索，已經明確芽孢桿菌至少在中國某一大類白酒釀造中具有重要的地位和作用，因此進一步探索芽孢桿菌在中國白酒生產中的實際應用方式以及工藝控制條件是目前需要更多加以關注的方面，而且通過這些研究，有望推動中國白酒生產的機械化升級以及控制工藝升級，推進中國白酒的現代化工藝升級。