反式-2-己烯醛對獼猴桃貯藏過程擴展青霉生長的抑制作用

段騰飛，李 昭，岳田利，夏秋霞，孟江洪

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反式-2-己烯醛對獼猴桃貯藏過程擴展青霉生長的抑制作用

段騰飛1,2，李 昭1，岳田利1※，夏秋霞1，孟江洪1

（1. 西北農林科技大學食品科學與工程學院，楊凌 712100；2.宿州學院生物與食品工程學院，宿州 234000）

為研究反式-2-己烯醛對擴展青霉生長及展青霉素產生的抑制作用。選取反式-2-己烯醛和研究報道的8種具有抑菌效果的物質對5株擴展青霉進行體外抑菌試驗，研究反式-2-己烯醛的抑菌效果并測定其最小抑菌濃度，然后進行獼猴桃活體試驗，通過測定硬度、可溶性固形物、可滴定酸、維生素C、pH值等指標研究反式-2-己烯醛對獼猴桃品質的影響，并采用高效液相檢測抑菌試驗前后獼猴桃活體中展青霉素含量，最終通過掃面電子顯微鏡觀察反式-2-己烯醛對5株擴展青霉形態的影響。結果反式-2-己烯醛與8種抑菌物質相比，反式-2-己烯醛抑菌效果最好，能夠完全抑制5株擴展青霉生長且得到對5株試驗菌的最小抑菌濃度（MIC，minimum inhibitory concentration）；反式-2-己烯醛能夠極顯著降低擴展青霉對獼猴桃果實硬度、可滴定酸、維生素C的的影響（<0.01），并且對獼猴桃硬度、可溶性固形物、pH值和還原糖及維生素C含量等沒有極顯著影響（>0.01），極顯著降低了染菌獼猴桃果實的腐爛率（<0.01），較好的保持了獼猴桃品質，經反式-2-己烯醛處理的染菌獼猴桃均沒有展青霉素檢出；掃面電子顯微鏡顯示5株試驗菌出現菌絲皺縮、折疊、干癟，孢子生成減少現象。研究反式-2-己烯醛對擴展青霉生長及展青霉素產生均具有很好的抑制作用，可為開發具有抑菌作用可替代農藥的天然產物提供理論基礎。

果實；菌；貯藏；反式-2-己烯醛；擴展青霉；抑菌效果；獼猴桃；展青霉素

0 引 言

擴展青霉是一種引起獼猴桃、蘋果、梨等水果腐敗變質的常見霉菌，并且許多擴展青霉在侵染水果及其制品的過程中會產生展青霉素（patulin）。展青霉素又稱棒曲霉素，是一種主要由青霉屬（）和曲霉屬（）產生的次級代謝產物[1-2]，具有致癌、致畸、致突變和廣泛的生理及細胞毒性[3]，當人體攝入過量展青霉素時，會出現惡心、抽搐、呼吸困難、甚至暈厥等一系列的急性和慢性病癥[4-5]。

獼猴桃（）又稱“奇異果”，含有豐富的氨基酸、維生素、膳食纖維及多酚類化合物，具有顯著的生物活性和抗氧化能力，由于其果肉鮮美，口感酸甜，營養豐富，深受大眾的喜愛[6-7]。中國是獼猴桃發源地，并且是世界上獼猴桃最大生產國，其中陜西地區分布最多[8]，獼猴桃在成熟后期果實逐漸變軟、果皮較薄，因此在采摘、加工、運輸等過程中容易感染擴展青霉，產生展青霉素且展青霉素會在果實內遷移，加速獼猴桃的腐敗變質，不僅造成人力和財力浪費，還對人體健康造成危害[9]。因此研究一種安全、有效的方法控制獼猴桃及其制品霉變和展青霉素積累變得十分必要，也是保證獼猴桃及果汁產業快速、健康發展的核心問題之一。

近年來，國內外學者對食品中展青霉素的控制主要通過物理、化學和生物方法直接去除食品中的展青霉素或者殺滅展青霉素產生菌，從源頭上控制展青霉素的產生，目前研究較多的物理方法主要采用吸附[10]、紫外線輻照[11-12]、超聲波[13]、分子印跡技術[14-15]、低溫等離子體[16]等，該方法操作簡單，但對于水果及其制品品質影響和廣泛應用仍需進一步探索。化學方法主要采用殺菌劑[17]、臭氧[18]、果汁護色劑[19]等抑制擴展青霉的生長，操作方便，但是長期使用會增強病原菌抗藥性，同時會造成環境污染，威脅人類健康。生物方法主要采用微生物（酵母菌[20-21]、乳酸菌[22]芽孢桿菌[23]等）抑菌和天然產物（生物堿類、黃酮類、精油類等）抑菌[24-27]。天然產物多是存在于植物中的生物活性物質，來源廣泛，成本低，抑菌效果顯著，同時能夠很好的保持食品中營養物質，具有很大發展潛力。

本試驗比較了反式-2-己烯醛和文獻研究報道的8種具有抑菌作用的檸檬酸、檸檬烯、蘋果酸、-氨基丁酸、槲皮素、兒茶素、雙乙酸鈉、草酸[28-32]對5株擴展青霉的體外抑菌效果，并測定反式-2-己烯醛最小抑菌濃度（MIC）及其對獼猴桃理化指標（硬度、可溶性固形物、還原糖、可滴定酸、pH值、維生素C）的影響，最終通過測定染菌獼猴桃中展青霉素含量和掃面電子顯微鏡觀察，研究反式-2-己烯醛對擴展青霉生長及展青霉素生成的抑制作用，以期得到一種天然、安全、有效的抑菌產物抑制擴展青霉生長及毒素積累。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株：CICC40658、CGMCC3.3703購自中國工業微生物菌種保藏管理中心，為擴展青霉標準菌株；LPH6、LPH5為實驗室分離菌株，分離于蘋果；WY為實驗室分離菌株，分離于獼猴桃。

獼猴桃品種為秦美（Qinmei）購自楊凌陽光超市；展青霉素標品純度為99%以上，購于美國Sigma-Aldrich公司。檸檬酸、檸檬烯、蘋果酸、-氨基丁酸、槲皮素、兒茶素、雙乙酸鈉、草酸、反式-2-己烯醛純度均為98%以上，購于阿拉丁有限公司。

購自陜西楊凌陽光超市。氫氧化鈉、鄰苯二甲酸氫鉀、酚酞、次氯酸鈉硫酸銅、次甲基藍、酒石酸鉀鈉、亞鐵氰化鉀、乙酸乙酯、乙酸、鹽酸等試劑均為國產分析純。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基：去皮馬鈴薯200 g，蒸餾水1 000 mL，煮沸20 min至馬鈴薯切塊變軟，過濾并定容至1 000 mL，再加入葡萄糖20 g、瓊脂20 g。

馬鈴薯葡萄糖液體培養基（potato dextrose broth，PDB）：PDA培養基不加瓊脂。

1.2 材料與設備

LC-2010ATH高效液相色譜，日本島津有限公司；S-4800場發射掃描電子顯微鏡，日本日立公司；RE-5205旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠；DK-98-II恒溫水浴鍋，天津市亞泰斯儀器有限公司；UV-2550型紫外可見分光光度計，日本島津公司；雷磁 PHS-3C型pH計，上海儀電科學儀器股份有限公司；WYT-4型阿貝折射儀，泉州中友光學儀器有限公司；GY-4 型數顯硬度計，浙江托普儀器有限公司；鍍鉻游標卡尺，寶雞市量具有限公司；SC-3610低溫離心機，安徽中科中佳科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 9種抑菌物質對擴展青霉抑制作用

1）孢子懸液制備

取4 ℃保存的5株擴展青霉CICC40658、CGMCC3.3703、LPH6、LPH5、WY，分別接種到100 mL PDB培養基中活化，28 ℃培養5 d，劃線法轉接至PDA斜面培養基，28 ℃培養7 d后，用無菌水沖洗PDA斜面培養基制成孢子濃度為1.0×106cfu/mL孢子懸液。

2）菌餅制備

取100L（濃度為1.0×106cfu/mL）5株擴展青霉孢子懸液，接種至PDA培養皿，28℃培養48 h。用200L移液槍槍頭尾部在菌株培養基上打孔，并用注射器針頭挑取制成菌餅，試驗均在無菌條件下進行。

3）9種抑菌物質體外抑菌試驗

制備10組PDA培養基，每組300 mL，滅菌待冷卻至50 ℃時每組分別加入一定量的檸檬酸、檸檬烯、蘋果酸、-氨基丁酸、槲皮素、兒茶素、雙乙酸鈉、草酸、反式-2-己烯醛，使抑菌物質濃度為5 mg/mL，同時加入15 mg吐溫80助溶混合均勻，迅速倒于培養皿中冷卻。將制得的CICC40658、CGMCC3.3703、LPH6、LPH5、WY菌餅分別接種于含有抑菌物質的PDA培養基平皿中。設置空白對照，每組平行3次。

4）菌落直徑的測定

將接種有菌餅的含有抑菌物質的PDA培養皿置于28 ℃恒溫箱避光培養5 d，每天同一時刻采用十字交叉法測量菌落直徑，每組平行3次。

5）稀釋后草酸和反式-2-己烯醛對擴展青霉生長的影響

為進一步研究草酸和反式-2-己烯醛對擴展青霉的抑制效果，將一定量的草酸和反式-2-己烯醛分別加入PDB培養基進行等濃度梯度稀釋，使其濃度分別為5、2.5、1.25、0.625、0.312 5 mg/mL，28 ℃培養5 d，觀察是否有菌絲生成，并用劃線法轉接至PDA培養皿中，28 ℃培養48 h，觀察是否有菌落形成。

1.3.2 反式-2-己烯醛最小抑菌濃度測定

制備5組PDA培養基，每組300 mL，滅菌待冷卻至50 ℃時加入一定量反式-2-己烯醛（MIC, minimum inhibitory concentration），使其濃度依次為40、60、80、100L/L，將制得的CICC40658、CGMCC3.3703、LPH6、LPH5、WY菌餅分別接種于含有抑菌物質的PDA培養皿中，28 ℃培養12 d，從第2天開始，每天同一時間采用十字交叉法測量菌落直徑。設置空白對照，每組平行3次。

1.3.3 反式-2-己烯醛對獼猴桃品質的影響

1）獼猴桃活體試驗

挑選大小、硬度相近、無病害的新鮮獼猴桃果實，用1% NaClO溶液浸泡2 min，無菌水沖洗干凈，置于無菌操作臺中晾干待用。然后用直徑3 mm的無菌鐵釘在獼猴桃赤道部位打孔，孔深5 mm，用移液槍分別取10L、1.0×106cfu/mL 5株試驗菌的孢子懸液注入孔中侵染獼猴桃，經添加反式-2-己烯醛100L/L的為處理組（S），未添加反式-2-己烯醛的染菌獼猴桃為未處理組（T），未染菌和反式-2-己烯醛處理的獼猴桃為空白組，每組10個獼猴桃計算獼猴桃腐爛率，將試驗獼猴桃置于保鮮袋中28 ℃培養7 d。

2）樣品制備

在試驗獼猴桃打孔附近0.5～2 cm取15 g均勻試樣（精確到0.01 g）置于100 mL離心管中，漩渦震蕩5 min，10 000 r/min，離心15 min，轉移上清液于50 mL離心管中，4 ℃備用。

3）指標測定

硬度的測定：GY-4 型數顯硬度計直接測定；可溶性固形物含量（soluble solids content，SSC）的測定：采用阿貝折射儀測定；pH值的測定：采用pH計直接測定；還原糖含量測定：采用3,5-二硝基水楊酸法測定，結果以葡萄糖含量計；可滴定酸測定：采用酸堿滴定法測定。維生素C含量測定：采用2,6-二氯靛酚法，參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用實驗方法》。每個理化指標測定3次。

1.3.4 反式-2-己烯醛對展青霉素產生的影響

1）展青霉素提取與測定

在試驗獼猴桃打孔附近0.5～2 cm取10 g均勻試樣（精確到0.01 g）于100 mL離心管中，加入20 mL無菌水，勻漿1 min，然后加入150L果膠酶溶液混合均勻，置于40 ℃水浴鍋中水浴2 h，用20 mL乙酸乙酯重復提取兩次，萃取上清液。水浴中減壓濃縮至干，用1.5 mL pH值為4水溶液（乙酸調節）溶解殘渣，經0.22m濾膜過濾，供高效液相色譜測定。

2）色譜條件

采用Eclipse Plus C18 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5m），流動相為乙腈-水體積比（10∶90），梯度洗脫。流速：1.0 mL/min，柱溫：30 ℃，進樣量：20L，檢測波長：276 nm。

1.3.5 反式-2-己烯醛對擴展青霉菌體及孢子生成的影響

通過掃面電子顯微鏡觀察反式-2-己烯醛對擴展青霉菌絲形態和孢子生成數量的影響。將制得的CICC40658、CGMCC3.3703、LPH6、LPH5、WY菌餅分別接種于反式-2-己烯醛濃度為40L/L的PDA培養皿中，28 ℃恒溫培養5 d。設置空白對照，每組平行3次。取試驗組和空白組樣品在4 000 r/min下離心6 min，棄掉上清液，加入1 mL 4%戊二醛固定液4℃下固定2 h。然后用0.1 mol/L pH值為6.8的磷酸鹽緩沖液進行漂洗，5、10、15、20、25、30 min時各漂洗一次。再用1%鋨酸常溫固定2 h，重復上述磷酸鹽緩沖液漂洗之后分別用30%、50%、70%、80%、90%乙醇進行梯度脫水。最后經真空冷凍干燥，噴金后進行場發射掃面電鏡觀察，并拍照。

1.4 數據統計分析

采用Origin9.0軟件做圖，SPSS 22.0軟件對試驗數據進行方差分析和多重比較，分析顯著性。

2 結果與分析

2.1 9種抑菌物質對展青霉體外抑菌效果

試驗選取反式-2-己烯醛和文獻研究報道的8種具有抑菌作用的物質(質量濃度均為5 mg/mL)對5株擴展青霉菌株進行體外抑菌試驗，結果如表1。

表1 9種抑菌物質對擴展青霉菌生長的影響

注：同一行相同字母代表不同天然抑菌物質對相應菌株的抑菌效果在<0.01水平上沒有極顯著差異, CICC40658和CGMCC3.3703為擴展青霉標準菌株；LPH6、LPH5和WY為實驗室分離菌株,下同。

Note: Same letter on the same line means that the antibacterial effect of different natural antibacterial substances on the corresponding strains was not significantly different at<0.01 level. CICC40658 and CGMCC3.3703 are standard strains for; LPH6, LPH5 and WY are laboratory isolates, the same below.

與空白組相比，48和96 h時，槲皮素和兒茶素對標準菌CICC40658沒有顯著抑制作用（0.01），120 h時，9種天然抑菌物質對標準菌CICC40658均具有極顯著抑制作用（0.01），且抑菌效果從大到小依次為：反-2-己烯醛＞草酸＞雙乙酸鈉＞兒茶素＞檸檬酸＞-氨基丁酸＞蘋果酸＞槲皮素＞檸檬烯；48 h時，檸檬酸和-氨基丁酸對標準菌CGMCC3.37038具有極顯著促進作用（0.01），120 h時，8種天然抑菌物質對標準菌CGMCC3.3703具有極顯著抑制作用（0.01），且抑菌效果從大到小依次為：反-2-己烯醛＞草酸＞雙乙酸鈉＞兒茶素＞蘋果酸＞-氨基丁酸＞槲皮素＞檸檬酸，其中檸檬烯對標準菌CGMCC3.3703生長出現顯著促進作用（0.01），菌落直徑從3.39增長到3.56 cm；在48、72、96和120 h時，兒茶素和-氨基丁酸對分離菌LPH5生長均出現顯著促進作用（0.01），120 h時，4種天然物質對分離菌LPH5具有極顯著抑制作用（0.01），且抑菌效果從大到小依次為：反-2-己烯醛＞草酸＞雙乙酸鈉＞檸檬酸，其中蘋果酸和檸檬烯對分離菌LPH5沒有顯著抑制作用（0.01）；在48、96和120 h時，雙乙酸鈉和-氨基丁酸對分離菌LPH6生長具有顯著促進作用（0.01），120 h時，7種天然物質對分離菌LPH6具有顯著抑制作用（0.01），且抑菌效果從大到小依次為：草酸＞反-2-己烯醛＞兒茶素＞檸檬烯＞檸檬酸＞蘋果酸＞槲皮素；在48、72、96和120 h時，5種天然物質對分離菌WY具有顯著抑制作用（0.01），120 h時抑菌效果從大到小依次為：草酸＞反-2-己烯醛＞雙乙酸鈉＞檸檬酸＞蘋果酸，其中4種天然物質對分離菌WY具有顯著促進作用（0.01），促進效果從大到小依次為：-氨基丁酸＞槲皮素＞檸檬烯＞兒茶素。綜上所述，9種天然物質中反-2-己烯醛和草酸在48、72、96和120 h均對5株擴展青霉菌株具有顯著抑制作用，且抑菌效果較好。

稀釋后草酸和反式-2-己烯醛的抑菌效果如表2所示：草酸在稀釋不同倍數后，濃度低于1.25 mg/mL時，抑菌效果降低，28 ℃培養5 d，PDB培養基變渾濁，5株試驗菌均有菌絲產生，PDA培養皿均有菌落檢出，這可能是由于草酸稀釋后氫離子濃度降低抑菌效果受pH影響引起的[31]；而反式-2-己烯醛在稀釋濃度為0.312 5 mg/mL時，仍對5株試驗菌具有很好的抑制作用，28 ℃培養5 d，PAB培養基保持澄清，5株菌均未出現菌絲，PAD培養皿均未有菌落檢出。因此后續試驗選擇反式-2-己烯醛為最佳抑菌物質進行研究。

表2 不同質量濃度天然抑菌物質對擴展青霉菌生長的影響

注：“+”代表PDB、PDA培養基有菌絲產生、培養基有菌落生長；“-”代表PDB、PDA培養基沒有菌落生長。

Note: “+” represents hyphae production in PDB and PDA medium; “-” represents no hyphae production in PDB and PDA medium.

2.2 最小抑菌濃度（MIC）測定結果

由表3可知：反式-2-己烯醛對標準菌CICC40658和CGMCC3.3703、分離菌LPH5、LPH6和WY的最小抑菌濃度（MIC）依次為100、80、80、80、80L/L，當反式-2-己烯醛濃度為100L/L時均未檢測到菌生長。當反式-2-己烯醛濃度為40L/L、培養12 d時，抑菌率依次為0.18%、6.81%、3.30%、40.38%、2.96%，5株試驗菌對反式-2-己烯醛敏感程度從大到小依次為LPH6＞CGMCC3.3703＞LPH5＞WY＞CICC40658；當反式-2-己烯醛濃度為60μL·L-1、培養12天時，抑菌率依次為3.87%、9.44%、24.18%、58.68%、6.25%，5株試驗菌對反式-2-己烯醛敏感程度從大到小依次為LPH6＞LPH5＞CGMCC3.3703＞WY＞CICC40658。當反式-2-己烯醛體積濃度分別為40和60L/L，隨著培養時間增加，抑菌效果有所降低，當反式-2-己烯醛濃度為40L/L，與空白組相比，培養時間在第11和第12天時，反式-2-己烯醛對標準菌CICC40658沒有極顯著抑制作用（>0.01），培養時間在第9和第10天時，反式-2-己烯醛對分離菌LPH5沒有極顯著抑制作用（>0.01）。隨著反式-2-己烯醛濃度增加，抑菌效果增強，與空白組相比，相同培養時間下，不同濃度的反式-2-己烯醛對標準菌CGMCC3.3703、分離菌LPH6和WY均具有極顯著抑制作用（0.01）；當反式-2-己烯醛濃度為60L/L時，反式-2-己烯醛對標準菌CICC40658和分離菌LPH5均具有極顯著抑制作用（<0.01），因此，在一定濃度下，反式-2-己烯醛對5株擴展青霉具有顯著抑制作用（<0.01）。

表3 反式-2-己烯醛對5株試驗菌最小抑菌濃度測定

注：“-”代表菌落未生長，同一列相同字母代表不同濃度的反式-2-己烯醛對相應菌株的抑菌效果在<0.01水平上差異極不顯著。

Note:“-” represents the colony does not grow, the same column of the same letter represents the different concentrations of trans-2-hexenal antibacterial effect on the corresponding strains at the<0.01 level of the difference is extremely insignificant.

2.3 反式-2-己烯醛對獼猴桃品質的影響

反式-2-己烯醛對獼猴桃果實硬度的影響如表4所示：第1天，處理組、對照組獼猴桃果實硬度均沒有極顯著差異（>0.01），第7天時，獼猴桃果實硬度均是空白組＞處理組＞未處理組，其中侵染擴展青霉LPH6的獼猴桃果實硬度降低至最初的23.80%，3組果實硬度值分別為4.12（空白組）＞4.01（處理組）＞1.88（未處理組），可能是由于擴展青霉在獼猴桃上生長，造成果實軟化變質[9]；反式-2-己烯醛處理組獼猴桃果實硬度均大于未處理組，差異極顯著（P<0.01）說明反式-2-己烯醛可以在一定程度上抑制擴展青霉在獼猴桃上快速生長，降低擴展青霉對獼猴桃果實硬度的影響；與空白組相比，處理組獼猴桃果實硬度稍低，但并沒有極顯著差異（>0.01），說明反式-2-己烯醛對獼猴桃果實硬度沒有顯著影響

反式-2-己烯醛對獼猴桃可溶性固形物（soluble solids content，SSC）含量的影響：第1天，空白組、未處理組和處理組，其中處理組與空白組的試驗獼猴桃可溶性固形物含量（SSC）沒有極顯著差異（>0.01）；第7天，試驗獼猴桃SSC均為空白組＞處理組＞未處理組，其中處理組與空白組獼猴桃SSC沒有極顯著差異（>0.01），說明反式-2-己烯醛對獼猴桃SSC沒有極顯著影響（>0.01），而未處理組侵染獼猴桃SSC含量極顯著低于處理組（<0.01），說明反式-2-己烯醛處理可以在一定程度上降低侵染獼猴桃可溶性固形物含量上升，抑制擴展青霉對獼猴桃品質的影響。與空白組相比未處理組獼猴桃果實SSC極顯著降低，其中侵染分離菌LPH6獼猴桃SSC降低6.38%，可能由于隨著培養時間增加，擴展青霉適應酸性環境，在獼猴桃上快速生長繁殖，消耗各種可溶性營養物質；

反式-2-己烯醛對獼猴桃可滴定酸含量和pH值的影響：第1天，空白組、未處理組和處理組試驗獼猴桃可滴定酸含量和pH值均沒有極顯著差異（>0.01），第7天，試驗獼猴桃可滴定酸含量為未處理組＞處理組＞空白組，試驗獼猴桃pH值為空白組＞處理組＞未處理組，隨著貯藏時間，空白獼猴桃可滴定酸含量持續下降和pH值上升，但變化比較緩慢分別為：26.19%和12.79%，其中未處理組獼猴桃可滴定酸含量高于空白組，且差異極顯著（<0.01），可能是由于擴展青霉在獼猴桃上快速生長，產生酸類物質；第7天，與空白組相比，處理組獼猴桃可滴定酸含量和pH值均沒有顯著差異（>0.01），說明反式-2-己烯醛處理對獼猴桃pH值沒有極顯著影響（>0.01），并且在一定程度上可以抑制染菌獼猴桃pH值的升高；

反式-2-己烯醛對獼猴桃還原糖含量的影響：第1天，試驗獼猴桃還原糖含量均沒有極顯著差異（>0.01），第7天，試驗獼猴桃還原糖含量均空白組＞處理組＞未處理組，未處理組染菌獼猴桃還原糖含量極顯著低于空白組（<0.01），其中未處理組侵染分離菌LPH6獼猴桃還原糖質量分數降低5.53%，處理組降低1.91%，說明反式-2-己烯醛處理可以在一定程度上抑制染菌獼猴桃還原糖含量降低，降低擴展青霉產生菌對獼猴桃品質的影響，試驗獼猴桃還原糖含量處理組與空白組沒有極顯著差異（>0.01），說明反式-2-己烯醛處理對獼猴桃還原糖含量沒有顯著影響。

反式-2-己烯醛對獼猴桃維生素C含量的影響：第1天，試驗獼猴桃維生素含量均沒有極顯著差異（>0.01），第7天，試驗獼猴桃維生素含量為空白組＞處理組＞未處理組，隨著貯藏時間，空白獼猴桃維生素質量分數下降14.02%，未處理組染菌獼猴桃維生素含量極顯著低于空白組（<0.01），其中未處理組侵染分離菌LPH6獼猴桃還原糖質量分數降低33.73%，處理組降低16.62%，說明反式-2-己烯醛處理可以在一定程度上抑制染菌獼猴桃維生素含量降低，降低擴展青霉產生菌對獼猴桃品質的影響，試驗獼猴桃維生素含量處理組與空白組沒有極顯著差異（>0.01），說明反式-2-己烯醛處理對獼猴桃維生素含量沒有顯著影響。

反式-2-己烯醛對獼猴桃果實腐爛率的影響：第1天，獼猴桃果實并未發病，果實完好，第7天，未經反式-2-己烯醛處理的染菌獼猴桃大量腐爛，而處理組染菌獼猴桃腐爛率顯著降低未處理組，其中接種擴展青霉LPH6獼猴桃腐爛率為98.87%，處理組腐爛率為28.31%，說明反式-2-己烯醛對擴展青霉有顯著抑制作用（<0.01），能夠降低染菌獼猴桃的腐敗變質。

表4 反式-2-己烯醛對獼猴桃品質的影響

注：“S”表示未加入反式-2-己烯醛處理，“T”表示加入一定濃度的反式-2-己烯醛處理。

Note: “S”means that trans-2-hexenal is not added and “T” means that a certain concentration of trans-2-hexenal is added.

2.4 反式-2-己烯醛對展青霉素生成的影響

從表5中可以看出，未用反式-2-己烯醛處理的染菌獼猴桃，除標準菌CGMCC3.3703未檢測到展青霉素外，其余四株擴展青霉都產生展青霉素，且含量均高于水果原汁、原漿等半制品中展青霉素質量分數18~953g/kg），可能原因是獼猴桃果實pH值較低，適宜于擴展青霉產生毒素以及毒素累積[9]。而用反式-2-己烯醛處理的染菌獼猴桃均未檢出展青霉素，說明反式-2-己烯醛不僅對擴展青霉生長具有很好抑制作用還能夠有效抑制擴展青霉在獼猴桃上產生毒素與毒素累積。

表5 反式-2-己烯醛對生成展青霉素質量分數的影響

2.5 掃面電鏡結果

反式-2-己烯醛處理前后5株擴展青霉的掃面電鏡結果由圖1所示：正常的分離菌LPH6菌絲生長茁壯，相互間交織形成繁茂的菌絲體，菌絲體頂端產生多細胞的分生孢子梗，梗末端分裂成串的分生孢子，呈掃帚狀，孢子為規則橢球形，形態飽滿（圖1a），經反式-2-己烯醛處理的分離菌LPH6 菌絲生長稀疏，菌絲體明顯減少，形態雜亂，且未觀察到孢子產生（圖1b）；正常的分離菌LPH5菌絲光滑飽滿，形態呈規則管狀，有少量橢球形孢子產生，形態飽滿（圖1c），經反式-2-己烯醛處理的分離菌LPH5菌絲出現明顯皺縮、干癟現象，形態呈條帶狀且未觀察到孢子產生（圖1d）；正常的標準菌CICC 40658、CGMCC 3.3703和分離菌WY菌絲生長茁壯、形態呈規則管狀，表面光滑飽滿（圖1e、圖1g、圖1i），經反式-2-己烯醛處理后3株擴展青霉菌絲均出現生長稀疏，菌絲形態呈條帶狀，出現明顯皺縮、干癟、螺旋現象（圖1f、圖1h、圖1j）；由上述可知，一定濃度的反式-2-己烯醛不僅影響擴展青霉菌絲正常生長，還會抑制孢子產生，從而影響擴展青霉正常繁殖達到抑菌效果。

圖1 反式-2-己烯醛處理前后5株擴展青霉的掃描電子顯微鏡圖

3 討 論

本文選擇天然存在于獼猴桃中的反式-2-己烯醛對5株擴展青霉進行體外抑菌試驗和獼猴桃活體試驗，首先以文獻報道的8種具有抑菌作用的物質做對比，分別將5株擴展青霉菌餅接種于含有反式-2-己烯醛和8種抑菌物質濃度為5 mg/mL的PDA培養基中，進行體外抑菌試驗，結果表明與8種抑菌物質相比，反式-2-己烯醛的抑菌效果最好，但是由于離體抑菌效果與實際應用中獼猴桃果實保鮮效果存在一定差異，因此后續試驗可以對高溫自發氣調情況下，9種抑菌劑對獼猴桃果實保鮮效果進行研究，確定反式-2-己烯醛對獼猴桃果實保鮮效果。試驗采用直徑3 mm的無菌鐵釘在獼猴桃赤道部位打孔，接種10L、1.0×106cfu/mL 5株試驗菌的孢子懸液的方法模擬獼猴桃感染擴展青霉菌，通過添加濃度100L/L的反式-2-己烯醛進行獼猴桃活體抑菌試驗，研究反式-2-己烯醛對獼猴桃品質的影響，試驗結果表明反式-2-己烯醛能夠較好保持獼猴桃的品質，但是由于反式-2-己烯醛的抑菌效果在試驗模擬條件下和獼猴桃自然條件下感染青霉菌可能存在差異，因此需要對自然條件下侵染青霉菌的獼猴桃進行活體試驗，以進一步驗證反式-2-己烯醛在實際應用中對獼猴桃上擴展青霉抑制效果及品質的影響。試驗通過掃面電鏡初步探索了反式-2-己烯醛的抑菌機理，結果發現反式-2-己烯醛不僅能夠使5株擴展青霉菌絲出現明顯皺縮、干癟、螺旋等現象，還能夠抑制孢子的繁殖和展青霉素的產生及積累。但是對于反式-2-己烯醛引起擴展青霉細胞死亡的原因還未完全揭示，后續試驗可以通過測定擴展青霉細胞膜通透性、電勢變化及作用靶點等進一步研究反式-2-己烯醛的抑菌機理。

4 結 論

本文選取反式-2-己烯醛和8種文獻報道具有抑菌效果的物質對5株擴展青霉進行體外抑菌試驗，研究反式-2-己烯醛的抑菌效果并測定最小抑菌濃度，通過獼猴桃活體試驗進一步研究了反式-2-己烯醛對獼猴桃品質影響，并初步探索了抑菌機理，得到以下結論：

1）與8種文獻報道具有抑菌效果物質相比，反式-2-己烯醛能夠極顯著抑制5株擴展青霉生長（<0.01），具有最佳抑菌效果，反式-2-己烯醛對標準菌CICC40658和CGMCC3.3703、分離菌LPH5、LPH6和WY的最小抑菌濃度（MIC）依次為100、80、80、80、80L/L。

2）試驗采用100L/L反式-2-己烯醛對感染5株擴展青霉的獼猴桃進行處理，結果發現，反式-2-己烯醛能夠極顯著抑制染菌獼猴桃果實硬度、可滴定酸、維生素C含量的快速下降（<0.01），并且對獼猴桃果實硬度、SSC、pH值和還原糖含量均沒有極顯著影響（>0.01），較好的保持了獼猴桃的品質。

3）高效液相法測定獼猴桃中展青霉素含量和掃面電鏡觀察反式-2-己烯醛處理前后5株擴展青霉形態變化，發現反式-2-己烯醛不僅能夠使5株擴展青霉菌絲出現明顯皺縮、干癟、螺旋等現象，還能夠抑制孢子的繁殖和展青霉素的產生及積累。

研究結果為獼猴桃的保鮮貯藏及擴展青霉污染控制和毒素積累奠定基礎，并為天然抑菌物質在農產品中實際應用提供一定依據，但是反式-2-己烯醛對擴展青霉抑菌機理仍需進一步研究。

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Study on inhibitory effect of trans-2-hexenal on growth ofat kiwi fruit storage

Duan Tengfei1,2, Li Zhao1, Yue Tianli1※, Xia Qiuxia1, Meng Jianghong1

(1.,712100,; 2.,234000,)

Patulin is a neurotoxic secondary metabolite that causes a series of acute and chronic conditions such as enteritis, dyspnea and cancer when the body consumes excessive amounts. China is the birthplace of kiwifruit and the largest producer of kiwifruit in the world. A large number of studies had shown that kiwifruit is susceptible to infection with penicillium expansum () and patulin accumulation during harvesting, storage and processing which not only causes waste, but also harms human health. Therefore, it is necessary to study a safe and effective method to controland patulin accumulation of kiwifruit and its products.Trans-2-hexenal is a characteristic aroma component naturally present in kiwi, apple and other fruits. Studies had shown that trans-2-hexenal has a certain inhibitory effect on microorganisms. This article studied the inhibitory effect of hexenal on the growth ofand the production of patulin. Firstly, the five strains of(CICC40658, CGMCC3.3703, LPH6, LPH5, WY) were inoculated into PDA medium plates containing bacteriostatic substance concentration of 5 mg/mL which kept at 28 ℃and the diameter of the colony was measured by the cross method every day.Study the antibacterial effect of trans-2-hexenal and eight antibacterial substances reported in the literature (citric acid, limonene, malic acid,-aminobutyric acid, quercetin, catechin, sodium diacetate, oxalic acid) on 5 strains of. Determined the minimum inhibitory concentration of trans-2-hexenal by antibacterial test of 5 strains ofwhen trans-2-hexenal at a concentration of 40, 60, 80, 100L/L.Then 3 mm of sterile iron nails were used to perforate the equator of kiwifruit and 10L 1.0×106cfu/mL spore suspension of 5 test strains were inoculated which simulating injury of kiwifruit secondary infection. The kiwifruit in vivo test was carried out by adding trans-hexenal aldehyde at a concentration of 100L/L and determined the kiwifruit hardness, soluble solids, titratable acid, reducing sugar, vitamin C, pH value and fruit decay rate to study the effect of trans-2-hexenal on the quality of kiwifruit and the patulin content in kiwifruit was measured by HPLC. Lastly, the effect of trans-2-hexenal on the morphology of 5 strains ofwas observed by scanning electron microscope. The results shown: Compared with the eight antibacterial substances, trans-2-hexenal had the best antibacterial effect and it could completely inhibit the growth of 5 strains of Penicillium expansum. The minimum inhibitory concentration (MIC) of the five strains was 100, 80, 80, 80 and 80L/L, respectively; trans-2-hexenal significantly reduced the effect ofon kiwi fruit firmness, titratable acid and vitamin C (<0.01)and had no significant effect (>0.01) on the fruit firm, soluble solids, pH value and reducing sugar content of kiwifruit. The rot rate of kiwi fruit withwas reduced and the quality of kiwifruit was better maintained by Trans-2-hexenal. All the aldehyde-treated kiwifruits were not detected by patulin; the scanning electron microscope showed that the five strains showed hyphal shrinkage, folding, drying, and sporulation reduction. Trans-2-hexenal has a good inhibitory effect on the growth ofand the production of patulin and provides a theoretical basis for the development of natural products with antibacterial effects.

fruit;bacteria; storage; trans-2-hexenal;; antibacterial effect; kiwi; patulin

10.11975/j.issn.1002-6819.2019.02.037

TS255.44

A

1002-6819(2019)-02-0293-09

2018-04-11

2018-12-01

國家自然科學基金項目(31371814)；宿州區域發展協同創新中心開放課題（2016szxt04）

段騰飛，助教，主要研究方向為農產品加工與綜合利用。Email：duantf@alu.hit.edu.cn

岳田利，教授, 博士生導師；主要研究方向為生物技術及食品安全控制技術。Email：yuetl@nwsuaf.edu.cn

段騰飛，李 昭，岳田利，夏秋霞，孟江洪. 反式-2-己烯醛對獼猴桃貯藏過程擴展青霉生長的抑制作用[J]. 農業工程學報，2019，35(2)：293－301. doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2019.02.037 http://www.tcsae.org

Duan Tengfei, Li Zhao, Yue Tianli, Xia Qiuxia, Meng Jianghong. Study on inhibitory effect of trans-2-hexenal on growth ofat kiwi fruit storage[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2019, 35(2): 293－301. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2019.02.037 http://www.tcsae.org